| 研究課題/領域番号 |
25291027
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 研究機関 | 九州大学 |
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研究代表者 |
藤田 雅俊 九州大学, 薬学研究科(研究院), 教授 (30270713)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | GRWD1 / Pura / p53 / EDD / リボソーム蛋白質 / ヒストンシャペロン |
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| 研究概要 |
（１）転写因子Puraの機能・制御へのGRWD1の関与の解明 ：まず、p53、GRWD1、Pura間の物理的相互作用が確認された。いくつかの細胞株で、GRWD1あるいはPuraをsiRNAで抑制すると、DNAダメージによるp53上昇レベルに変化がないにもかかわらずp21発現誘導が促進された。また、p53反応性p21プロモーターにおいて、GRWD1とPura の過剰発現がp53発現による転写活性化を抑制することがわかった。ただ、現時点では影響は相乗的ではない。一方、GRWD1のChIP-Seqデータの解析から、p21プロモーター領域でp53結合部位とGRWD1結合部位の一部が近接していることが示唆された。以上結果は、GRWD1がp53と共にプロモーター部位に結合し、その転写活性化能を抑制制御している可能性を示唆している。GRWD1ががん細胞で過剰発現していることを考えると、これはp53機能を抑制することにより、発がん促進的に働いているのかもしれない。
（２）ユビキチンリガーゼEDDの機能・制御へのGRWD1の関与の解明 ：GRWD1抑制によりEDD量が増加することがわかったが、これは転写レベルあるいは蛋白質分解レベルではないことが示唆されつつある。そこで、EDDの翻訳制御へ影響を与えている可能性を検討している。
（３）GRWD1の核小体機能への関与の検討：GRWD1が核小体蛋白質RPL5やRPL23と強固に結合していることが明らかになりつつある。そこで、GRWD1が核小体機能・制御に関与している可能性の検討も新たに始めた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
全体的に、概ね順調に進んでいると考えている。まず、「転写因子Puraの機能・制御へのGRWD1の関与の解明」については、上述のように極めて興味深い結果を得ており、さらに研究を進めている。次に、「ユビキチンリガーゼEDDの機能・制御へのGRWD1の関与の解明」についてであるが、まずGRWD1抑制によりEDD量が増加することが判明した。しかし、当初予想していたEDDのユビキチン化を介した分解制御にGRWD1が関与していると言う仮説は否定された。また、GRWD1がヒストンシャペロンであることから、上記p21転写制御のように、EDDの転写レベルに影響している可能性も検討したが、こちらも否定的であった。このように、EDDとGRWD1の関連の研究に関しては、やや困難に面している所もある。しかし、下述のように新たな仮説のもと検討を進めたい。最後に、「GRWD1の核小体機能への関与の検討」についてであるが、GRWD1が核小体構造の維持に必要であることを示唆するデータや、核小体ストレス応答制御に関与している可能性などが新たに浮かんで来ており、今後の展開が待たれる。
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| 今後の研究の推進方策 |
（１）転写因子Puraの機能・制御へのGRWD1の関与の解明 ：上述したこれまでの結果を鑑み、以下の検討を行いたい。① GRWD1とPura の過剰発現とsiRNAによる抑制を組み合わせ、p53反応性p21プロモーター抑制へのそれぞれの関与を検討する。②当該プロモーターへのGRWD1、Puraの結合をChIP法で調べる。③転写抑制能へのGRWD1酸性ドメインの寄与を調べる。④併せて、当該領域opennessへのGRWD1、Puraの影響をFAIRE-qPCRやヒストンChIP-qPCR法で調べる。⑤p53、GRWD1、Pura間の物理的相互作用の詳細を調べ（直接結合かどうか等）、さらに相互作用を減弱させるそれぞれの変異の同定を試み、それらの当該反応への影響を調べる。⑥GRWD1の過剰発現が、p53応答経路を抑制するのかどうかを明らかにする。⑦ 可能ならば、PuraのChIP-Seqも行い、p53やGRWD1のデータと比較検討したい。
（２）ユビキチンリガーゼEDDの機能・制御へのGRWD1の関与の解明 ：GRWD1抑制によりEDD量が増加することがわかったが、これは転写レベルあるいは蛋白質分解レベルではないことが示唆されつつある。そこで、EDDの翻訳制御へ影響を与えている可能性を検討する。①EDD蛋白質翻訳量へのGRWD1抑制の影響を、アイソトープラベルメチオニンの取り込みで調べる。②GRWD1抑制が、EDD mRNA制御に関与する何らかのmiRNA量に影響を与えていないか、miRNAアレイを用いて検討する。
（３）GRWD1の核小体機能への関与の検討：GRWD1が核小体蛋白質RPL5やRPL23と強固に結合していることが明らかになりつつある。そこで、GRWD1が核小体機能・制御に関与している可能性の検討も新たに始めたい。① GRWD1抑制が核小体構造の崩壊を引き起こすとの予備的結果を得ており、さらに検討を進める。② PRL5等はMDM2ユビキチンリガーゼに結合・阻害することでp53の安定化を誘導し、核小体ストレス応答を誘導すると考えられている。この制御系にGRWD1が関与する可能性を検討する。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
上述したように、GRWD1抑制によるEDD量増加のメカニズムについて、当初予想していたEDDのユビキチン化を介した分解制御にGRWD1が関与していると言う仮説や、GRWD1がEDDの転写レベルに影響している可能性が否定され、その解明にやや手間取っている。そのため、その後の解析の一部が平成26年度にずれ込んだ。
上述した今後の研究方針に従い、平成26年度の研究費と併せ、研究の邁進のために適切に執行して行きたい。
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