| 研究課題/領域番号 |
25291031
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
豊島 陽子 東京大学, 総合文化研究科, 教授 (40158043)
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| 研究分担者 |
矢島 潤一郎 東京大学, 総合文化研究科, 准教授 (00453499)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | ダイニン / 自己制御機構 / 拡散運動 / 一方向運動 / スタック構造 |
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| 研究実績の概要 |
本研究において，ヒト培養細胞で発現した組換え体ダイニン重鎖を含むダイニン複合体を観察したところ，1分子ではATP存在下で微小管上をフラフラと拡散的に運動し，一方向性の運動は見られないことを前年度までに示した。今回、ヌクレオチド条件を固定することで、サイクルの各状態がダイニンの拡散運動とどのように対応しているかを調べると、ATP加水分解の過渡状態であるADP・Pi状態を模すADPとVi（バナジン酸）を添加した条件においてのみ大きく拡散する運動が観察された。この結果は、飽和ATP存在下において，多くのダイニン分子がADP・Pi状態にトラップされていることを示唆している。さらに、各ヌクレオチド条件におけるダイニンの分子形態を電子顕微鏡で観察したところ、拡散的な挙動に対応する飽和ATP存在下とADP・Vi条件では、二つの頭部を重ね合わせたような特徴的な形態（スタック構造）が支配的である一方、その他の条件では二つの頭部が互いに離れた形態（セパレート構造）が支配的であることが明らかになった。スタック構造においては，ダイニンの二つの微小管結合部位は互いに逆の方向を向いていることになり、正しい向きで微小管と相互作用できる結合部位が１つに制限されることになる。つまり、スタック構造のダイニンは，実効的なモータードメインの数としては単頭状態になり、２つのモータードメインを利用した連続的な運動が行えない状態になっていると推測される。実際，遺伝子組み換えによって，ダイニンの2つのモータードメインの間に剛性の高いリンカーを挿入するなどしてスタック構造の形成を阻害すると運動の一方向性が顕著になるので、１分子のダイニンは、スタック構造をとることで微小管上を拡散的に運動する状態になっていると考えられる。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
各ヌクレオチド状態における1分子の運動動態と電顕による分子形態の観察から、スタック状態とセパレート状態の分子形態と運動動態を関連付けることができた。さらに、スタック状態は他のモータータンパク質では見られていないダイニン特有の自己制御機構であることを示すことが出来た。
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| 今後の研究の推進方策 |
ダイニンのスタック状態(自己制御状態）が時間スケールでどの程度安定に存在するのかを各ヌクレオチドの存在下で調べる。そのために、ダイニン頭部に蛍光標識用のタグを導入し、2種類の波長の蛍光色素で標識し、その色素間のFRETを1分子レベルで観察する。また高速AFMを用いて、2つの頭部のスタック状態とセパレート状態の像を観察することを目指す。
さらにスタック状態を解除して、一方向性の運動を始めるために必要な要件がどのようなものであるか、光ピンセットまたは磁気ピンセットを利用して、メカニカルな視点から摂動を与えるなどして調べる。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
超遠心機のスウィングローターを更新予定であったが、更新時期に来ているものの、最高回転数を下げて使用すれば問題ないことがわかり、運転時間を延長して対応したところ、目的の実験にかなうことが判明した。超遠心機については、ドライブユニットが故障し交換を行ったので、予定以上に費用がかかったため、今年度はスウィングローターの更新をおこなわず、来年度に購入することにした。
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| 次年度使用額の使用計画 |
今年度に更新を行わなかった超遠心機のスウィングローターを購入する予定である。
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