| 研究課題/領域番号 |
25291037
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 研究機関 | 横浜市立大学 |
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研究代表者 |
佐藤 衛 横浜市立大学, 生命医科学研究科, 教授 (60170784)
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| 研究分担者 |
小田 隆 横浜市立大学, 生命医科学研究科, 特任助教 (00573164)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | 溶液散乱 / 小角散乱 / クロマチン / ヌクレオソーム / セントロメア |
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| 研究概要 |
真核生物のDNAはヌクレオソームが数珠状に連なったクロマチン構造をとり高度に折れ畳まれて核内に収納されている。転写やDNAの複製・修復の際には、クロマチン構造はダイナミックに変化する。本研究では、細胞分裂期に重要な働きをする染色体のセントロメア領域の高次ヌクレオソーム複合体や、転写・複製・修復に関与するヒストンバリアントを含む高次ヌクレオソーム複合体の構造をX線及び中性子溶液散乱法で解析し、ヒストンバリアントの使い分けによる高次ヌクレオソーム複合体の動態を解析する。平成25年度はH2AのバリアントであるH2A.B (別名H2A.Bbd) を含むモノ・ヌクレオソームのＸ線溶液散乱解析を行った。また、セントロメア特異的なヒストンバリアント(CENP-A)を含む高次ヌクレオソーム複合体のＸ線溶液散乱解析も行った。
その結果、H2A.Bモノ・ヌクレオソームの解析では、通常であればヒストン８量体に硬く巻きついている約146塩基対のDNAの両端が、H2A.Bヌクレオソームではヒストン８量体から剥がれ、大きく揺らいでいることを明らかにした。この結果は、他の生化学および細胞生物学的な解析と合わせて論文にまとめ(Arimura et al. 2013, Scientific reports)、H2A.Bのもつこのような性質から転写・複製・修復の際に緩んだクロマチン領域にこのようなヌクレオソームが形成されることを示した。また、セントロメア領域の高次ヌクレオソーム複合体の解析では、通常の高次ヌクレオソーム複合体と比べ、大きく動態が異なることを示すデータが得られた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
当初計画していたとおり、本年度はヒストンバリアントを含むモノ・ヌクレオソーム及びセントロメア高次ヌクレオソーム複合体をＸ線溶液散乱法により解析し、通常のモノ・ヌクレオソームあるいはモノ・ヌクレオソームが複数連なった高次ヌクレオソーム複合体との構造的な差異を示すデータを得ることができた。
さらに、H2A.Bモノ・ヌクレオソームの解析では、通常であればヒストン８量体に硬く巻きついている約146塩基対のDNAの両端が、H2A.Bヌクレオソームではヒストン８量体から剥がれ、大きく揺らいでいることを明らかにし、他の生化学および細胞生物学的な解析と合わせて論文にまとめた(Arimura et al. 2013, Scientific reports)。したがって、おおむね計画どおり順調に研究が進展していると判断した。
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| 今後の研究の推進方策 |
実際の核内のクロマチンはリンカーヒストンやその他のタンパク質因子等が結合し、動態が制御されている。したがって、本年度に明らかにしたヒストンバリアントの使い分けによる高次ヌクレオソーム複合体の構造変化が最終的なクロマチン構造にどのように影響するのか明らかにするために、リンカーヒストンあるいはセントロメア特異的なタンパク質因子を結合させた高次ヌクレオソーム複合体を調製して、同様の解析を進めていく予定である。
また、申請書に記載した、１．重水素化リンカーヒストンH1および重水素化CENP-Bの調製と１種類のヒストンバリアントだけを重水素化した高次ヌクレオソーム複合体の調製、２．１種類のヒストンバリアントだけを重水素化した高次ヌクレオソーム複合体に重水素化リンカーヒストンH1が結合した複合体の調製と中性子溶液散乱解析、３．１種類のヒストンバリアントだけを重水素化した高次ヌクレオソーム複合体に重水素化CENP-Bが結合した複合体の調製と中性子溶液散乱解析、などについても順次行っていく予定である。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
今年度（H25年度）の実験はすべてＸ線を利用した溶液散乱実験を行ったために、高額な重水素化試薬を購入する必要がなかったことと、試料の調製および精製を共同研究先で行ったためにタンパク質精製用クロマトシステム（AKTA FPLC）を購入する必要がなかった。そのために次年度使用額が生じた。
今年度以降は中性子線を利用した溶液散乱実験をスタートさせ、１．重水素化リンカーヒストンH1および重水素化CENP-Bの調製と１種類のヒストンバリアントだけを重水素化した高次ヌクレオソーム複合体の調製、２．１種類のヒストンバリアントだけを重水素化した高次ヌクレオソーム複合体に重水素化リンカーヒストンH1が結合した複合体の調製、３．１種類のヒストンバリアントだけを重水素化した高次ヌクレオソーム複合体に重水素化CENP-Bが結合した複合体の調製等を順次行っていくために、今年度の研究費と合わせた額で、高額な重水素化試薬を購入するととともに、こうして購入した高額な重原子原子試薬を使って大量の試料を精製する必要があるので、タンパク質精製用クロマトシステム（AKTA FPLC）のカラムを購入する計画である。
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