Ｘ線及び中性子溶液散乱法による高次ヌクレオソーム複合体の動態構造解析

2014 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 25291037
• 研究機関: 横浜市立大学
• 研究代表者: 佐藤 衛 横浜市立大学, 生命医科学研究科, 教授 (60170784)
• 研究分担者: 小田 隆 横浜市立大学, 生命医科学研究科, 特任助教 (00573164)
• 研究期間 (年度): 2013-04-01 – 2016-03-31
• キーワード: 溶液散乱 / 小角散乱 / クロマチン / ヌクレオソーム / セントロメア

研究実績の概要

H2AのバリアントであるH2A.Bを含むモノヌクレオソーム(H2A.Bモノヌクレオソーム)の中性子溶液散乱（SANS）解析を行った。H2A.Bモノヌクレオソームは通常のH2Aを含むモノヌクレオソーム（H2Aモノヌクレオソーム）と生化学的な性質が異なるため、立体構造に大きな違いがあるものと推測されているが、結晶構造は明らかにされていない。昨年度のＸ線溶液散乱（SAXS）解析から、H2Aモノヌクレオソームでは146bpのDNAがヒストン8量体にしっかりと巻きついているのに対し、H2A.BモノヌクレオソームではDNAの両端の20~30bpがヒストン8量体からはがれて大きく揺らいだ状態にあることが推測されていた。そこで、本年度のSANS実験では溶媒の重水と軽水の比を変化させることで溶媒とヒストンとDNAの散乱のコントラストを変化させて測定を行った。その結果、H2A.BヌクレオソームのDNAは両端がヒストン8量体からはがれていることが明確に確認でき、このような性質によりH2A.Bは緩んだ状態のクロマチンを形成できることが明らかになった。さらに、ヌクレオソーム内部のヒストン8量体にも構造の違いが観測された。この違いはヒストンテールの構造状態の違いによるものと推測された。また、セントロメア特異的なCENP-A（H3のヒストンバリアント）を含むヌクレオソーム（CENP-Aモノヌクレオソーム）についてもSAXS解析を行った。これまでの研究からCENP-Aモノヌクレオソームもヒストンに巻きついたDNAの両端がはがれていることが示されている(Tachiwana et al, 2011 Nature)。そこで、H3またはCENP-Aを含む3つのヌクレオソームをつないだトリヌクレオソーム（H3-CENP-A-H3)のSAXSを測定したところ、H3-H3-H3のトリヌクレオソームとは異なる散乱パターンが観測され、動的な構造に違いがあることが示され、セントロメア領域のクロマチン構造の違いを反映していることが示唆された。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

昨年度行ったＸ線溶液散乱（SAXS）解析で推測されたH2AとH2AのバリアントであるH2A.Bを含むモノヌクレオソームの違いをコントラスト変調法を利用した中性子溶液散乱（SANS）で解析し、H2A.BヌクレオソームのDNAは両端がヒストン8量体からはがれていることを実験的に証明し、このような性質によりH2A.Bは緩んだ状態のクロマチンを形成できることを明らかにしたこと、および、H3またはCENP-Aを含む3つのヌクレオソームをつなげたトリヌクレオソームのSAXSを測定し、H3-CENP-A-H3トリヌクレオソームとH3-H3-H3トリヌクレオソームが異なる散乱パターンを示して両者の動的構造に違いがあることを明らかにし、本研究の目的である高次ヌクレオソーム複合体の動態解析に目途を立てることができたことなどから、おおむね順調に進展していると判断した。

今後の研究の推進方策

H2A.BモノヌクレオソームおよびH3-CENP-A-H3トリヌクレオソームについて、分子動力学シミュレーションを行う。これにより通常のH2AモノヌクレオソームおよびH3-H3-H3トリヌクレオソームとの動的な挙動の違いを解析し、これらのヒストンバリアントが高次のクロマチン構造に与える影響を明らかにする。
このような巨大複合体では実際の溶液中の分子挙動を正しく再現するためには計算と実験の両面で様々な工夫が必要である。そこで、分子動力学計算では全原子シミュレーションの代わりに疎視化シミュレーションを行う。疎視化シミュレーションではアミノ酸残基１つを１粒子、塩基１つを３粒子とすることで巨大複合体を簡素化し、全原子シミュレーションでは追えないような長時間にわたる大規模な構造変化を追うことができる。しかし、疎視化シミュレーションでは各粒子間に働く相互作用を全原子シミュレーションのように正確に再現できないので、正しく解析を行うために計算パラメータを様々に変動させて計算を行い、得られる構造アンサンブルからSAXSおよびSANSの散乱パターンを計算し、実測の散乱パターンとの一致度を確認しながら解析を行う。
同時に、これまでに収集したSAXSデータおよびSANSで観測されたヒストン8量体とDNAの散乱パターンを利用する。ただし、前述のように、疎視化シミュレーションでは静電相互作用などのパラメータを様々に変えて計算するため、必要に応じてSAXSおよびSANS実験でも塩強度を変えて測定し、これらとの一致度を確認しながら解析を行う。
さらに、特定のヒストンバリアントを重水素化することでそのヒストンバリアントのみの散乱パターンをSANSで収集し解析の精度をあげる。なお、分子動力学シミュレーションは横浜市立大学の池口博士、京都大学の高田博士、原子力研究機構の河野博士らと協力して進める予定である。

次年度使用額が生じた理由

今年度（H26年度）におけるタンパク質の発現・調製・精製実験は、昨年同様に共同研究先で行ったのでタンパク質精製用クロマトシステム（AKTA FPLC）を購入する必要がなかった。また、超低温で安定保存するタンパク質の量もそれほど多くはなかった。そのために次年度の使用額が発生した。

次年度使用額の使用計画

今年度は高次ヌクレオソームの構造・動態解析を本格化させるために、タンパク質精製は昨年同様に共同研究で行うが、様々なヒストンバリアントを含む高次ヌクレオソームを大量に調製する必要があること、さらに、当該構造・動態解析を様々な物理条件や溶媒条件で行う必要があるため、高純度の高次ヌクレオソームを常時大量に調製し、かつ決められたマシンタイム時に大型施設に出張して行うＸ線・中性子溶液散乱実験まで超低温で安定に保存する必要がある。そのために超低温フリーザー（パナソニック・MDF-U73VS5）を購入する計画である。加えて、昨年度に引き続き、高次ヌクレオソームの中性子溶液散乱測定を計画しているため、そのために必要な高額の重水および重水素化試薬の購入も計画している。

研究成果

• [雑誌論文] A magnetic anti-cancer compound for magnet-guided delivery and magnetic resonance imaging (2015)
  • 著者名/発表者名: H. Eguchi, M. Umemura, R. Kurotani, H. Fukumura, I. Sato,.J-. H. Kim, Y. Hoshino, J. Lee, N. Amemiya, M. Sato, K. Hirata, D. J. Singh, T. Masuda, M. Yamamoto, T. Urano, K. Yoshida, K. Tanigaki, M. Yamamoto, M. Sato, S. Inoue, I. Aoki, Y. Ishikawa
  • 雑誌名: Scientific Reports 巻: 5 ページ: 9194-9207
  • DOI: 10.1038/srep09194
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Charge-neutralization effect of the tail regions on the histone H2A/H2B dimer structure (2015)
  • 著者名/発表者名: K. Saikusa, S. Shimoyama, Y. Asano, A. Nagadoi, M. Sato, H. Kurumizaka, Y. Nishimura, Akashi S
  • 雑誌名: Protein Sci. 巻: 24 ページ: 1224-1231
  • DOI: 10.1002/pro.2673
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Molecular basis for SMC rod formation and its dissolution upon DNA binding (2015)
  • 著者名/発表者名: Y. Soh, F. Bürmann, H. Shin, T. Oda, K. S. Jin, C. P. Toseland, C. Kim, H. Lee, S. J. Kim, M. Kong, M. Durand-Diebold, Y. Kim, H. M. Kim, N. K. Lee, M. Sato, B. Oh, S. Gruber
  • 雑誌名: Mol. Cell 巻: 57 ページ: 290-303
  • DOI: doi: 10.1016/j.molcel.2014.11.023
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Distinct Features of the Histone Core Structure in Nucleosomes Containing the Histone H2A.B Variant (2014)
  • 著者名/発表者名: M. Sugiyama, Y. Arimura, K. Shirayama, R. Fujita, Y. Oba, N. Sato, R. Inoue, T. Oda, M. Sato, R. K. Heenan, and H. Kurumizaka
  • 雑誌名: Biophysical J. 巻: 106 ページ: 2206-2213
  • DOI: doi: 10.1016/j.bpj.2014.04.007
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [学会発表] タンパク質の天然変性領域を標的にした創薬 (2015)
  • 著者名/発表者名: 佐藤 衛
  • 学会等名: 翻訳後修飾プロテオミクス医療研究拠点の形成―平成26年度諮問委員会
  • 発表場所: 横浜市立大学附属病院
  • 年月日: 2015-03-10 – 2015-03-10
  • 招待講演
• [学会発表] Ｘ線溶液散乱法を中心にした軟らかなタンパク質の相関構造解析 (2014)
  • 著者名/発表者名: 佐藤 衛
  • 学会等名: 大阪大学蛋白質研究所セミナー
  • 発表場所: 大阪大学蛋白質研究所
  • 年月日: 2014-12-04 – 2014-12-05
  • 招待講演
• [学会発表] 赤痢菌IpaBによるMad2L2の機能阻害複合体の結晶学的研究 (2014)
  • 著者名/発表者名: 片川裕理、原 幸大、花岡祐樹、菊池壮太郎、横山英志、金 文秀、笹川千尋、佐藤 衛、橋本 博
  • 学会等名: 平成26年度日本結晶学会年会
  • 発表場所: 東京大学農学部
  • 年月日: 2014-11-01 – 2014-11-03
• [学会発表] Ｘ線溶液散乱を中心にした相関構造解析－揺らぎの大きい軟らかなタンパク質の構造解析を目指して (2014)
  • 著者名/発表者名: 佐藤 衛
  • 学会等名: 第87回日本生化学会大会
  • 発表場所: 国立京都国際会館
  • 年月日: 2014-10-15 – 2014-10-18
  • 招待講演
• [学会発表] 細胞表層ストレス応答制御に関わる膜内切断プロテアーゼRsePのタンデムPDZドメインによる切断基質選別機構の解析 (2014)
  • 著者名/発表者名: 檜作 洋平, 小田 隆, 田畑 早苗, 川上-田村 恵子, 大井里香, 佐藤 衛, 高木 淳一, 禾 晃和, 秋山 芳展
  • 学会等名: 第87回日本生化学会大会
  • 発表場所: 国立京都国際会館
  • 年月日: 2014-10-15 – 2014-10-18
• [学会発表] Structural dynamics of tri-nucleosome studied by combination of coarse grained molecular simulation and SAXS (2014)
  • 著者名/発表者名: Yusuke Takagi, Yuichi Kokabu, Takashi Oda, Hiroaki Tachiwana, Hiroo Kenzaki, Hitoshi Kurumizaka, Mamoru Sato, Mitsunori Ikeguchi, Shoji Takada
  • 学会等名: 日本生物物理学会第52回年会
  • 発表場所: 札幌コンベンションセンター
  • 年月日: 2014-09-25 – 2014-09-27
• [学会発表] Structural and mutational analysis of a PDZ tandem of intramembrane cleaving protease RseP (2014)
  • 著者名/発表者名: Terukazu Nogi, Yohei Hizukuri, Sanae Tabata, Keiko Tamura-Kawakami, Takashi Oda, Mamoru Sato, Junichi Takagi, Yoshinori Akiyama
  • 学会等名: XXIII Congress of the International Union of Crystallography
  • 発表場所: Palais des congress de Montreal, Quebec, Canada
  • 年月日: 2014-08-05 – 2014-08-12
• [学会発表] DNA架橋損傷修復に関わる天然変性タンパク質Hefの構造研究 (2014)
  • 著者名/発表者名: 小田 隆、小林裕也、舘岡太郎、宮城泰城、石黒あかり、有田恭平、禾 晃和、石野良純、杉山正明、佐藤 衛
  • 学会等名: 第14回日本蛋白質科学会年会
  • 発表場所: ワークピア横浜（横浜）
  • 年月日: 2014-06-25 – 2014-06-27