| 研究課題/領域番号 |
25291063
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| 研究機関 | 岡山大学 |
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研究代表者 |
坂本 亘 岡山大学, 資源植物科学研究所, 教授 (20222002)
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| 研究分担者 |
高見 常明 岡山大学, 資源植物科学研究所, 技術職員 (70614254)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | 葉緑体 / ミトコンドリア / オルガネラ分化 / DNA分解 / 老化 / ステイグリーン / ヌクレアーゼ |
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| 研究実績の概要 |
25年度までにシロイヌナズナ切除葉で老化の暗黒誘導系を確立し、DPD１遺伝子が葉の老化（暗黒処理後３日目）で誘導されることを確認した。さらに、老化により葉緑体DNAが消失するが、dpd１変異体では残存することが明らかとなった。これらの結果から、葉老化でDPD1ヌクレアーゼによるオルガネラDNA分解を証明することができた。
26年度はdpd1変異体における老化葉の形質を確立した暗黒誘導系で詳しく調べたところ、dpd1変異体が弱いステイグリーン形質を示すことが明らかとなった。DPD1タンパク質の欠損により葉の老化が遅延することは、葉緑体DNAの残存による葉緑体遺伝子発現低下の抑制が原因と考えられたが、Real-time PCRの結果はこれらを支持する結果が得られた。以上の結果から、DPD1タンパク質による葉緑体DNA分解が葉の老化促進を規定する一因となっていることが今回明らかとなり、DPD1タンパク質によるDNAサルベージ機能と連鎖する葉老化の新たな側面を明らかにできた。
26年度はDPD1タンパク質によるオルガネラDNA分解を検証するために、タンパク質レベルでのDPD1タンパク質の誘導を確認することとin gelアッセイを用いてヌクレアーゼ活性を検出することを試みたが、どちらも誘導を結論づけるデータが得られなかった。老化葉でのタンパク質検出が大変困難であることがわかったので、27年度以降はin gelアッセイに集中して再度検出を試みるがこれが成功しない場合はタンパク質レベルでの検出は中断して他の研究に集中する。
葉の老化過程における代謝産物の変動について、暗黒誘導系の葉を用いてメタボローム解析を行った。dpd1変異体でヌクレオチド代謝に大きな変動は観察されなかった。さらに26年度はBrdUを取り込ませたトレーサー実験を行ってヌクレオチド転流の変化をdpd1変異体で観察したが、コントロールにおけるバックグラウンドが高いため、良好な結果を得ることはできなかった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究では根本問題として、葉の老化においてDPD1タンパク質によるオルガネラDNA分解を証明することが目的として挙げられている。これまでに、切除葉における老化の暗黒誘導系を連携研究者と協力してシロイヌナズナで確立し、①葉の老化過程においてDPD1遺伝子が顕著に発現誘導すること、②野生型シロイヌナズナでは、葉の老化過程でオルガネラDNAの消失が観察されるが、dpd1変異体ではDNAが残存すること、の２つを明らかにしている。これらの結果に加えて、
③dpd1変異体がステイグリーン形質を示して葉の老化が遅延すること
④dpd1変異体における老化の遅延は、葉緑体遺伝子発現低下の抑制と関連すること
が実験的に示されたので、葉の老化におけるDNA分解を実証することができ、当初の目標に沿った成果が得られている。
上記の成果により葉の老化におけるオルガネラDNA分解の実証ができたと判断しているが、一方で、老化葉のタンパク質検出（ウエスタンブロット）、in gelアッセイを用いたヌクレアーゼ活性の検出が予想以上に困難であることもわかってきた。これらは改善を試みるが、上述の結果を大きく変えるデータではないため、今後は他に集中して研究を進める。
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| 今後の研究の推進方策 |
DPD1による老化葉でのDNA分解を証明するための研究が当初の計画に沿って順調に進展している一方で、DNAサルベージを証明する実験についてはまだ解析が途中である。26年度の結果を踏まえ、27年度においては以下の点に注力して研究を推進する予定である。
①水耕栽培によるDPD1形質の評価
26年度までの成果からdpd1変異体では老化の遅延が確認され、オルガネラDNAが分解されない事により葉の長寿命化が起こる事が考えられる。一方でこれまでの葉の寿命に関する研究はコストベネフィットの概念を取り入れ個葉もしくは個体の光合成による炭素収支や窒素を中心とした栄養塩条件の観点から行われてきている。DPD1タンパク質がオルガネラDNAを分解しサルベージ機構として機能しているという作業仮定からdpd1変異体では低栄養条件下においては生長抑制が起こる事が予想される。以上のことから27年度では水耕栽培により低栄養条件下でのDPD1遺伝子発現誘導、オルガネラDNA分解、植物の生長解析を行い、DPD1タンパク質によるDNAサルベージの評価を行う。
②DPD1タンパク質の生化学的評価
老化葉を用いたタンパク質検出（ウエスタンブロット）やin gel アッセイによるDPD1タンパク質の活性評価をタンパク質の抽出条件に注意しながら再度試みる。タンパク質の検出や活性を検出できない場合は組換えタンパク質を用いたin gel アッセイによりDPD1タンパク質の基質特異性などの分子機能を生化学的に特徴づける。
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