| 研究課題/領域番号 |
25291067
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| 研究機関 | 基礎生物学研究所 |
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研究代表者 |
長谷部 光泰 基礎生物学研究所, 生物進化研究部門, 教授 (40237996)
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| 研究分担者 |
村田 隆 基礎生物学研究所, 生物進化研究部門, 准教授 (00242024)
石川 雅樹 基礎生物学研究所, 生物進化研究部門, 助教 (00586894)
西山 智明 金沢大学, 学際科学実験センター, 助教 (50390688)
玉田 洋介 基礎生物学研究所, 生物進化研究部門, 助教 (50579290)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | 幹細胞 / 全能性 / 植物発生 |
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| 研究実績の概要 |
1. STEMIN標的遺伝子の探索：(a) STEMIN-YFPを発現する原糸体を用いてChIP-seqを計画したが、STEMINにMycタグを融合させたタンパク質を発現するライン(STEMIN-Mycライン)で、茎葉体サンプルのChIP-seqに成功し、STEMIN結合部位を同定できた。また、茎葉体にSTEMINを12時間発現誘導したときのRNA-seqデータを勘案し、STEMINの直接標的遺伝子として98遺伝子を同定した。それら多くの遺伝子は、遺伝子発現の抑制に機能しているヒストンH3K27me3と、遺伝子発現の活性化に機能するヒストンH3K4me3の両方でマークされている状態、すなわちバイバレントな状態であることが分かった。(b) 茎葉体サンプルでのChIP-seqに成功したため、STEMIN誘導後の経時的なRNA-seq解析も、原糸体を取り止め茎葉体で行うことにした。STEMIN標的遺伝子は、切断葉の幹細胞化過程において切断後24時間目までに発現が上昇することから、STEMIN誘導後、1, 3, 6, 12, 24時間目の茎葉体のサンプリングを行った。
２. STEMIN結合タンパク質の探索：STEMIN-Mycラインを用いることで、茎葉体サンプルでの免疫沈降が可能であることが分かった。そこで、STEMIN-Myc複合体を精製するためのタンパク質抽出の条件検討を開始した。
３. STEMIN遺伝子制御ネットワークの解明：STEMINの機能を明らかにするうえで、STEMINの直接標的遺伝子、およびその結合タンパク質の探索が最優先課題であるため、上記の１.２.の実験に集中した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
STEMIN-YFPラインを用いたが実験条件を多数検討してもChIP-seqのための沈殿が生じなかったため。
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| 今後の研究の推進方策 |
補助期間延長承認申請時にはChIP-seqが全くうまくいっていなかったが、STEMIN-Mycラインを用いたことで事態が急転し、STEMIN標的遺伝子の同定に成功した。また、STEMIN-Mycタンパク質の免疫沈降が可能であることが分かったため、次年度で、当初計画していたSTEMINと結合するタンパク質の同定、および、それらタンパク質の幹細胞化における機能解析を進めることが可能となった。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
STEMIN-YFPを用いた実験がうまくいかず、その後の実験ができなかったため。
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| 次年度使用額の使用計画 |
残り期間で当初予定の実験を効率化して行う。分子生物学的実験に物品費、成果発表に旅費、繰り返し実験があるので技術支援員を雇用し研究を効率化するためと当該課題の予算処理事務を行うための事務支援員、論文投稿料として使用する。
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