研究課題
染色体再編に重要な役割を果たすと考えられているDNAの二本鎖切断が細胞内で生じるプロセスを理解することを目的として、DNA上の逆向き反復配列に依存した十字型DNA構造の形成とそれが引き起こす二本鎖切断と遺伝的不安定性の解析を進めており、以下の成果を得た。１）逆向き反復配列に依存した染色体異常を特異的に検出する実験系の構築：遺伝子改変が容易に行えるようにrpsL変異検出系を改変し、rpsL遺伝子配列の後半部を含む逆向き反復配列をrpsL遺伝子配列の下流に導入して、逆向き反復配列に依存した染色体異常を特異的に検出・解析する実験系を開発することにした。実験系に用いる大腸菌株の作成がほぼ完成したので、SbcCDとDNAトポイソメラーゼの効果を解析する準備をすすめている。２）SbcCDタンパク質の生化学的解析：精製したSbcCDと十字構造やヘアピン構造を含む各種DNA基質を用いて、詳細な酵素学的解析を行った。その結果、SbcCDは二本鎖DNAの長さに依存してヘアピンを含むDNA末端でのヌクレアーゼ反応のモードを変えることが明らかになった。３）逆向き反復配列IR-246に依存した十字構造の発生機構を解析するin vitro実験系の構築：タグ付きのTusタンパク質とタグにアフィニティを持つ磁気ビーズを用いて、複製装置が結合した状態での複製中間体をインタクトな状態で分離する技術を開発した。さらに、in vitro oriC系での反応をDNAジャイレースを加えずに進めた際に生じる複製フォークの進行が停止した複製中間体の定量解析を行い、この条件で複製中間体が安定して存在することを確認した。さらに、タグ付きのTusタンパク質を用いた分離法により、DNAジャイレース非存在下で生じる複製中間体を分離する実験を行い、この実験系が十分に解析に用いることができることを示した。
2: おおむね順調に進展している
in vivoでの解析については、DNAジャイレース阻害剤を用いた実験が思うような結果を生み出さなかったが、新たな変異検出系を開発して、逆向き反復配列に依存する染色体異常の発生を定量的に解析できるようになったので、成果が期待できると判断している。in vitroでの解析では、SbcCDの生化学的解析で新たな知見が得られ、現在、論文投稿中である。複製中間体の実験系もほぼ完成したので、今後の解析結果が期待される。
今後も遺伝学的解析と並行しながら、生化学的解析を進めて行く計画である。両方共に新しい実験系が完成しつつあり、順調に研究計画が進展している。このことから、ほぼ計画通りに研究を進めていく予定である。
遺伝学的解析において、変異頻度の解析や塩基配列決定にかなりの額の研究費を予定していたが、２６年度は実験系の開発が主であったために、次年度以降に計画が繰り越されることになったため。
変異頻度の解析や塩基配列決定に必要な試薬の購入、および生化学的解析に似強うな物品費として使用する。
すべて 2015 2014
すべて 雑誌論文 (2件) (うち査読あり 2件、 オープンアクセス 2件、 謝辞記載あり 2件) 学会発表 (8件) (うち招待講演 1件)
Nucleic Acids Research
巻: 43 ページ: 1715-1725
10.1093/nar/gkv044
巻: 42 ページ: 8461-8472
10.1093/nar/gku547
