| 研究課題/領域番号 |
25292035
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 研究機関 | 岡山大学 |
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研究代表者 |
能年 義輝 岡山大学, その他の研究科, 准教授 (70332278)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | 植物 / 酵素 / 生理活性 / 環境調和型農林水産 / プラントアクチベーター |
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| 研究概要 |
病害抵抗性誘導剤（プラントアクチベーター）は植物が持つ免疫力を活性化することによって病害防除効果を発揮する薬剤である。殺菌性農薬のように薬剤耐性菌によって効果が打破されない持続性、並びに農薬の散布量や回数を減らすことができる環境負荷低減効果を併せ持つことが特徴で、次世代型の植物保護手法として期待される。代表者は、独自の細胞ベースアッセイ法による化合物ライブラリーの探索から抵抗性誘導活性をもつ7個の植物免疫プライミング剤(インプリマチン)を単離した。そして、その一部が植物免疫ホルモンであるサリチル酸に糖を付加して不活性化するサリチル酸配糖化酵素(SAGT)を阻害して薬効を発揮することを突き止めた。そこで本研究では、実用化が期待されるレベルの強力なSAGT阻害剤の単離同定を目指し、シロイヌナズナのSAGTの一つであるUGT76B1を用いた標的ベース探索を進めている。本年度は、酵素による配糖化の進行具合を蛍光基質によって間接的に定量検出できる反応系(Kumagai et al., AnalBiochem, 2014)を用いたハイスループットアッセイ系を確立した。具体的には、ヒスチジンタグを融合させたシロイヌナズナのサリチル酸配糖化酵素の一つであるUGT76B1タンパク質を大腸菌によって発現精製し、384プレートを用いたSAGT酵素反応におけるコントロール値から算出されるS/B比、CV値、Z’値が基準をクリアするように、緩衝液組成、酵素量、時間、温度等を最適化するバリデーション作業を行った。そして東京大学創薬オープンイノベーションセンター(OCDD)の9,600個のコアライブラリー（終濃度10microM）のHTSを実施して30%以上活性を阻害するヒットを63個得た。現在、HPLCを用いた反応基質の定量によって、再現性と擬陽性排除を目的とした2次スクリーニングを行っている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
当初の計画では市販化合物ライブラリー(14,400個)をHPLCによって2年掛けてスクリーニングする予定だったが、ハイスループットスクリーニング系の開発導入と東京大学OCDDとの共同研究によって、1年目にして9,600個の化合物の探索を終えて候補薬剤の単離を達成することができた。
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| 今後の研究の推進方策 |
極めて有効な探索系を確立することができたので、当初の計画を大幅に超えた22万個の化合物のスクリーニングを実施する予定である。また、補完的手法として計画しているSICLOPPS法についても方法論の確立を目指す。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
探索方法の変更により、当初計画していたHPLCの購入を取りやめたため。また東京大学創薬オープンイノベーションセンターの化合物ライブラリーを使用したことにより、市販の化合物ライブラリーを購入する必要がなくなったため。
今後探索規模を22万化合物に拡大するにあたり、探索のための人件費、旅費、化合物購入費用として使用する。
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