| 研究課題/領域番号 |
25292040
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| 研究機関 | 独立行政法人農業環境技術研究所 |
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研究代表者 |
藤井 毅 独立行政法人農業環境技術研究所, その他部局等, 研究領域長 (00354100)
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| 研究分担者 |
齋藤 明広 静岡理工科大学, 理工学部, 准教授 (50375614)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | 遺伝子発現制御 / 転写カスケード / キチナーゼ / 抗生物質生産 / 放線菌 / 転写因子 |
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| 研究実績の概要 |
土壌においてキチン代謝関連遺伝子群や抗生物質生産遺伝子群の発現を制御することが明らかとなった転写因子の遺伝子dasRを固定化したアフィニティーレジンを用い、アフィニティーバインディングアッセイにより、dasR転写調節領域に特異的に結合するタンパク質のスクリーニングを行った結果、キチナーゼ関連遺伝子群の発現を誘導する誘導基質キトビオース存在下、および非存在下に特異的に、dasR転写調節領域に結合する複数のタンパク質を検出することができた。現在これらタンパク質のバンドを切り出し、トリプシン消化物の質量分析を行いタンパク質の同定を試みている。一方、昨年度見いだされた、欠損するとdasR遺伝子の発現が高まることが示唆された転写制御因子遺伝子を破壊した変異株を作成し、野生株とキナーゼ生産を比較した結果、破壊株はキチン存在下キチナーゼを大量生産する事が確認され、この転写因子はDasR 同様キチナーゼ遺伝子群の転写も正に制御する因子であることが明らかとなった。
一方、土壌抽出液からdasR や抗生物質生産系遺伝子の発現をキチン存在下高める活性画分の精製を試みたが、精製度を高めると活性が消失することから複数の活性化因子がこれら遺伝子の発現活性化に関与していることが示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
dasRを固定化したレジンを用いたアフィニティーバインディングアッセイにより、dasR転写調節領域に特異的に結合するタンパク質を複数のスクリーニングすることに成功すると共に、欠損することでdasRやキチナーゼ生産に変化を生じる転写因子の遺伝子を見いだす事ができたことから、研究の最終目的としているdasRを中心としたキチン代謝および抗生物質代謝のカスケード解明に大きく近づいた。
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| 今後の研究の推進方策 |
キチン代謝関連遺伝子群や抗生物質生産遺伝子群の発現を制御することが明らかとなった転写因子の遺伝子、dasRの転写調節領域に結合する複数のタンパク質について、トリプシン消化を行い質量分析からタンパク質の同定を試みる。同定に成功したものについては、その遺伝子破壊株を構築し、その変異株のキチナーゼ生産量とdasR転写量を野生株と比較する。また、dasRとキチナーゼ遺伝子群を正に制御していると考えられる転写因子の遺伝子破壊株については、キチン存在下増殖中の破壊株から経時的にRNAを抽出し、キチナーゼをはじめキチン代謝関連遺伝子群とdasR遺伝子や抗生物質生産関連遺伝子群の発現をRT-PCRで定量し、野生株と比較することで、この転写因子の機能を解析する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
研究を担当する雇用した契約職員が年次有給休暇を取得し当所の運営費交付金でその分を充当したことと、遺伝子工学用意試薬やキットの使用が当初見積もっていた額よりも少なかったため。
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| 次年度使用額の使用計画 |
来年度は、土壌における放線菌の遺伝子発現解析を多く予定していることから、土壌RNA抽出試薬およびRNA精製キットの購入とRT-PCR用試薬の購入に重点的に使用する。また、来年度は最終年度を迎えることから、論文作成のための英文校閲や投稿料にも予算を使用する予定である。
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