| 研究課題/領域番号 |
25292048
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 研究機関 | 岐阜大学 |
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研究代表者 |
鈴木 徹 岐阜大学, (連合)農学研究科(研究院), 教授 (20235972)
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| 研究分担者 |
片山 高嶺 石川県立大学, 公私立大学の部局等, 教授 (70346104)
福田 真嗣 慶應義塾大学, その他の研究科, 准教授 (80435677)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | 微生物 / 腸内細菌 / ビフィズス菌 / 遺伝子 / 遺伝子破壊 / 逆遺伝学 / ミルクオリゴ糖 / 共生細菌 |
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| 研究概要 |
ビフィズス菌は、ヒトの健康に大きな意味を持つ共生細菌である。近年、多くのビフィズス菌株のゲノム解析が行われたが、大腸菌や枯草菌の遺伝子の相同性でアノテーションされただけで、実験的に機能が解析された例はごく僅かであり、40%は相同性を示さず機能推定さえもなされていない。本研究では、この問題をブレイクスルーするため、新たに高効率な実用的遺伝子破壊法を構築し、ビフィズス菌の遺伝子破壊株コレクションを作成する。本研究では、ビフィズス菌に特有のオリゴ糖の代謝酵素とそのトランスポータ、調節タンパク質遺伝子の破壊株コレクションを作製し、これらの機能をメタボロミクスおよびタンパク質化学的手法によりシステマティックに明らかにすることで、ビフィズス菌-ヒト共生システムの分子機構の統合的理解を目指す。
これまでに、温度感受性プラスミド、pyrE遺伝子による正負両方向のマーカー遺伝子を用い、ひとつのベクターを作成した後、①目的の遺伝子を破壊するためのベクター構築②形質転換③ダブルクロスオーバー組換えによる遺伝子破壊、④セルフクロスオーバー組換えによるマーカー遺伝子の削除を行う事で、連続的に複数の遺伝子を破壊する方法が確率できた。ころを用いて、本年度は、2成分制御系のレスポンスレギュレーターを中心に２０株の破壊株の作成に成功した。また、メタボローム解析による変異株の代謝メカニズム解析を会わせておこない、変異株の機能解析系の構築を行っている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
現在までに、約20の遺伝子の破壊実験を行った。この中で、３つに関し安定した遺伝子削除株が得られす、必須遺伝子であると考えられた。現在、調節可能なプロモータを導入して必須性の検討を行っている。
このため、進行がやや遅れているが、今後も必須遺伝子の解析が必要であると考え実験系の確率を先行して行った。
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| 今後の研究の推進方策 |
破壊株作成に関しては、複数の遺伝子フラグメントを効率よく連結する改良型ゴールデンゲート法を開発したため、破壊効率が格段に改善させることに成功したため、この方法を用いて当初の約200遺伝子の破壊株作成とその機能解析を目指す。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
H25年度の消耗品費として予定していた菌学が計画より172,162円少なく済んだ、実験計画の遂行上合成DNA購入に必要な金額が若干少なかったためである。
H26年度の研究計画の中で、会わせて使用したい。
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