| 研究課題/領域番号 |
25292057
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
永田 宏次 東京大学, 農学生命科学研究科, 准教授 (30280788)
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| 研究分担者 |
中山 二郎 九州大学, (連合)農学研究科(研究院), 准教授 (40217930)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | 構造生物学 / 複合体構造 / 膜タンパク質 / 多剤排出輸送体 |
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| 研究実績の概要 |
１．FsrC-GBAP複合体およびFsrC-GBAP拮抗阻害剤複合体の結晶化および結晶構造解析（担当：永田）
FsrC-GBAP複合体の結晶化実験において従来より得られていた結晶は精製FsrC試料に微量混在していた宿主大腸菌の遺物排出輸送体AcrBの結晶であることが明らかになったため、AcrB遺伝子を欠失した大腸菌C41(DE3)ΔacrBを用いてFsrCを発現させたが、C41(DE3)の場合よりもFsrCの発現量が低下した。発現条件の最適化を再度行うために、FsrCのC末端側にsfGFPを融合させ、緑色蛍光強度により発現量を評価し、最適発現誘導条件を決定した。さらに、FsrCとセリンプロテアーゼ阻害剤との共発現によりFsrCの回収率を数倍高めることができた。また、結晶化を促進するために、FsrCのCysのSerへの置換、リン酸化されるHisのGlu（疑似活性型）またはVal（疑似不活性型）への置換を行い、FsrC（天然型）と同等の発現量が得られることを確認した。上記の検討により、AcrB不含のFsrC試料を安定して精製する系を確立した。今後、結晶化とX線結晶構造解析を進める。
２．GBAPおよびGBAP拮抗阻害剤の調製（担当：中山）
結晶化実験用のリガンドGBAPやGBAP拮抗阻害剤を化学合成した。
３．AcrBの結晶構造解析（担当：永田）
当初の目的から外れるが、FsrC精製試料に混在していたAcrBは大腸菌の多剤排出輸送体であり、我々の結晶構造はまだ報告されていないリガンド結合不活性型構造であると推測されたので、この結晶構造の高分解能化を目指した。大腸菌C41(DE3)にてAcrBを発現させ、精製AcrBと抗生物質との共結晶化を蒸気拡散法と脂質立方晶法とにより行い、両法にて結晶が得られた。今後、X線結晶構造解析を進める。
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| 現在までの達成度 (段落) |
27年度が最終年度であるため、記入しない。
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| 今後の研究の推進方策 |
27年度が最終年度であるため、記入しない。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
27年度が最終年度であるため、記入しない。
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| 次年度使用額の使用計画 |
27年度が最終年度であるため、記入しない。
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| 備考 |
【制菌】日和見感染や院内感染の原因菌である腸球菌は、クオルモン（GBAP）と呼ばれる化合物を恒常的に分泌し、 細胞表面のクオルモン受容体（FsrC）により同種菌の菌密度を感知します。我々は中山二郎先生（九大院農）と共同でGBAPがFsrCに結合するのを邪魔する「GBAPアンタゴニスト」の分子設計を進めており、その成果は腸球菌による日和見感染症や院内感染症の重篤化を防ぐ新規制菌剤の開発に役立ちます。
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