| 研究課題/領域番号 |
25292058
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 研究機関 | 東京工業大学 |
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研究代表者 |
福居 俊昭 東京工業大学, 生命理工学研究科, 准教授 (80271542)
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| 研究分担者 |
折田 和泉 東京工業大学, 生命理工学研究科, 助教 (70525964)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | 生物・生体工学 / 微生物工学 / 代謝工学 / 生分解性プラスチック / 代謝工学 |
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| 研究概要 |
1) ポリヒドロキシアルカン酸（PHA）生産菌Ralstonia eutrophaの代謝工学的改変による共重合PHA生合成について検討した。C4およびC6ユニットからなるP(3HB-co-3HHx)について植物油および糖質を原料とした際に有効な改変戦略をそれぞれ確立し、大豆油からP(3HB-co-11 mol% 3HHx)を乾燥菌体重量あたり80wt%で、フルクトースからP(3HB-co-22 mol% 3HHx)を48 wt%で生産する組換えを作製した。また基質特異性が非常に広いPHA重合酵素の遺伝子を染色体に導入することで、植物油からC4～C12ユニットからなるP(3HB-co-3HA)を様々な組成で生合成する組換え株のシリーズを作製したが、生産性にはまだ改善の余地の余地があった。C4およびC3ユニットからなるP(3HB-co-3HP)をグリセロールから生合成する組換え株を作製したが、3HP組成についは物性改善に有効な分率には到らず、さらなる検討を行う。
2) R. eutrophaに大腸菌由来グリセロール代謝遺伝子を導入することでグリセロール資化能を大幅に向上させた。詳細な検討から、大腸菌由来遺伝子の低レベル発現が重要であることを見いだした。
3)桂皮酸に由来する含芳香環ユニットの供給に必要な酵素のうち、桂皮酸: CoAリガーゼについてはイネ由来酵素の配列に基づいてコドン最適化をした人工遺伝子を用い、Pseudomonas putidaを宿主とした発現を確認した。また、保有する5種の(R)-エノイル-CoAヒドラターゼについてシンナモイル-CoAを基質とした活性測定を行い、R. eutropha由来酵素の１つが比較的高い活性を示すことを示した。一方でブロック共重合体生合成用に作製した組換え株ではPHA生産量はわずかであり、発現ベクターの改良と培養条件の検討が必要と考えられた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
R. eutrophaによるP(3HB-co-3HHx)生合成においては、植物油および糖質を原料とした培養条件の双方について、高い生産性を維持しつつ物性改善に有効な3HHx分率の共重合体を生合成する代謝改変を確立した。また、R. eutrophaを宿主とした代謝工学によって植物油からのP(3HB-co-3HA)生合成、グリセロールからP(3HB-co-3HP)生合成、グリセロール資化能の大幅向上が可能であることを示した。加えて、含芳香環ユニット含有PHAの生合成経路構築に必要な酵素の同定や発現を行い、総合して研究進展としておおむね順調と考えている。一方で、P(3HB-co-3HA)やP(3HB-co-3HP)の生合成については生産性や組成制御の点でまだ十分ではなく、またブロック共重合体の生合成はまだ達成されていない。問題となっている点が明らかとなりつつあることから、次年度以降の検討による改善が期待できる。
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| 今後の研究の推進方策 |
H25年度の成果を基に、 糖質炭素源からのP(3HB-co-3HHx)生合成経路については(S)-3HB-CoAを経由する経路の構築や大腸菌への人工生合成経路の導入を図り、さらに優れた生産株を確立する。 植物油からのP(3HB-co-3HA)生合成では培養条件特異的なPHA合成酵素遺伝子の発現抑制が示唆されており、その抑制機構の解明と抑制解除による生産性向上を検討する。グリセロールからのP(3HB-co-3HP)生合成ではR. eutrophaおよび大腸菌を宿主とした系における遺伝子高発現やPHA合成酵素の改変を進める。一方でR. eutrophaへのペントース資化能付与に関しては海外グループから同様の報告があったことから、当面は他の検討を優先する。また含芳香環基質に活性な酵素の遺伝子を導入したPseudomonas 属でまず芳香族化合物を前駆体とした新規共重合PHAの生合成を目指す。またブロック共重合体生合成系について発現ベクターの改良と培養条件の検討、生産ポリマーの構造解析を進める。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
遺伝子工学用試薬・酵素・キット類の消費が当初の想定より少なかったため、平成25年度では143,295円の繰越額が生じた。
本繰越額は平成26年度の試薬やDNA合成の購入費に充てる。
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