| 研究課題/領域番号 |
25292063
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| 研究機関 | 石川県立大学 |
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研究代表者 |
山本 憲二 石川県立大学, 生物資源環境学部, 教授 (70109049)
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| 研究分担者 |
加藤 紀彦 石川県立大学, 生物資源環境学部, 助教 (40724612)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | エンドグリコシダーゼ / オキサゾリン化合物 / 糖鎖リモデリング / 免疫グロブリンＧ / 抗体医薬 / Endo-M |
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| 研究実績の概要 |
本研究の目的の一つであるタンパク質に糖鎖を付加する糖転移活性が促進され、加水分解活性が抑制されたEndo-Mの変異酵素を取得することを試みた結果、従来、取得していたN175Q変異酵素の他にN175H変異酵素が効率的な糖転移活性を有することを見出した。すなわち、N175Qと同様に、オキサゾリン型糖鎖を供与体として用いることによって、効率的に糖転移生成物を得ることができる酵素であった。さらに、オキサゾリン型糖鎖のみならず、シアロ糖ペプチドのシアロ糖鎖を受容体に転移付加することも見出した。
そこで、N175Hを用いて、組換え糖タンパク質の糖鎖のリモデリングを試みた。すなわち、組換え酵母由来のヒトIgGについて、酵母型の高マンノース型糖鎖をヒト型糖鎖（シアロ複合型糖鎖）にN175H変異酵素を用いて変換することを検討した。まず、組換えIgGについてEndo-Hを作用させ、糖鎖の切断効率をヒトIgG抗体を用いたウェスタンブロッティングで調べたところ、ヒトIgGの重鎖の糖鎖が遊離したタンパク質が、SDS-PAGEによってもとの重鎖のタンパク質に比べて下方に移動していることを確認した。すなわち、Endo-Hを作用した組換えIgGについてはほとんど全ての糖鎖が遊離したことが確認された。そこで、このような糖鎖を除去したヒトIgGを用いて、糖鎖のすげ替えを行った。シアロ複合型二本鎖糖鎖を有する卵黄由来糖ペプチドを糖鎖供与体としてN175H変異酵素を用いて酵素反応を行い、ヒトIgG抗体を用いたウェスタンブロッティングによって調べた結果、シアロ糖鎖が付加された組換えIgGが見出された。また、シアル酸を認識するSNAレクチンを用いたブロッティングによってもシアロ糖鎖が付加されたことが確認され、これらの結果から、酵母で生産された組換えIgGの糖鎖がヒト型糖鎖に変換されたことを明らかにした。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
糖鎖付加技術の高度効率化と糖タンパク質の糖鎖のリモデリングの実現という目標について、おおむね大きな進展があった。すなわち、本研究の応用に向けた目標であるEndo-Mの変異酵素を用いた組換え糖タンパク質の糖鎖のヒト型糖鎖への変換に関して、未だプレリミナリーな段階ではあるが、リモデリングに成功することができた。とりわけ、バイオ医薬品として重要な抗体医薬であるヒトIgGを酵母で生産させて得られた組換え糖タンパク質の糖鎖をヒト型糖鎖に変換することに成功したことは今後のバイオシミラー医薬品の製造に向けて大きな貢献をすることになったと考える。今後はこのヒト型糖鎖を有する組換え糖タンパク質を大量に取得する方法を考えなければならない。すなわち、バイシミラー医薬品は安全性が担保されることが重要であり、厳密な安全性の諸問題をクリアーする必要があるが、その際に問題となるのが糖鎖の抗原性である。この問題を解決するためには抗原性を持たないことが既に知られている糖鎖をタンパク質へ付加する技術が重要になって来る。本研究において、Endo-Mの変異酵素により、ニワトリ卵黄から比較的に容易に得ることができる糖ペプチドの糖鎖を組換えヒトIgGに転移付加して、糖鎖をリモデリングできる技術を開発できたことは目標の達成に近づいたと考えられ、医薬や医療の分野への波及効果は大きいと考えている。
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| 今後の研究の推進方策 |
平成27年度の本研究の実施推進方策としては、Endo-M酵素を改変して、その基質特異性を拡大するために結晶化を行い構造解析を行って、基質が入り込むポケットを大きくした変異酵素を得ることを目的としている。先ず、（１）Endo-M酵素の結晶化を試みる。精製酵素をさまざまな結晶作成用の緩衝液を用いた条件下にて結晶化を試みて、その作成条件を検討し、確立する。（２）結晶化酵素についてＸ線構造解析を行う。（３）解析の結果を基にして、部位特異的変異を行うことにより活性中心のポケットを広げた変異酵素を取得する。すなわち、基質が活性中心のポケットに入り易いように周辺のアミノ酸残基を置換して、ポケットの部分を広げる操作を行う。立体構造が解析されて同じファミリーに属するEndo-M類似の酵素との比較によって、Endo-MのN-末端より251番目の芳香族アミノ酸であるトリプトファンが活性中心のポケットを狭めていることが推察される。前年度において、実際にこの残基をアラニンやアスパラギン残基に置換することによってL-フコースが糖鎖のコア部分に結合しているようなN-結合型糖鎖に対して、有効に作用することを確認している。（４）取得した変異酵素を用いて、その糖転移活性を利用することにより、幅広いさまざまな構造の糖鎖を持つ生理活性物質の合成を行う。本酵素は他起源の酵素と比較して高い糖転移活性を有する酵素であるので、広い基質特異性を獲得することができれば、その特異的な糖転移活性を用いて、糖鎖の異なるさまざまな生理活性物質のライブラリーを作成することが可能であり、糖鎖構造の多様性による化合物の機能や薬効の評価をすることができる。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
当初の目標としては今年度において、酵母由来の組換えIgGの他に、酵母で生産させた組換えサイトカインである糖タンパク質の糖鎖のリモデリングを実施する予定であった。そのための材料費と人件費を割り当てていたが、適当な組換え糖タンパク質のサイトカインを見つけることができなかったために次年度に実施する課題とした。そのために経費を使用することなく次年度使用額として残った。
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| 次年度使用額の使用計画 |
次年度使用額とした分については既に糖鎖のリモデリングを目的とした組換え糖タンパク質のサイトカインを入手したために次年度に行う研究の実施のための使用計画に入っている。従って、次年度使用額とした分はすべて使用予定である。
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