| 研究課題/領域番号 |
25292081
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
後藤 晋 東京大学, 農学生命科学研究科, 准教授 (60323474)
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| 研究分担者 |
北村 系子 独立行政法人森林総合研究所, 北海道支所, 主任研究員 (00343814)
久本 洋子 東京大学, 農学生命科学研究科, 助教 (60586014)
上野 真義 独立行政法人森林総合研究所, 森林遺伝領域, 研究員 (40414479)
岩田 洋佳 東京大学, 農学生命科学研究科, 准教授 (00355489)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | 標高 / フェノロジー / F2個体群 / マイクロサテライト / SNP / RNA / トドマツ / 次世代シーケンサー |
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| 研究概要 |
1．F2個体の2年目の表現型調査（後藤・石塚・岩田）：2年生のF2（297個体）の開芽期、苗高、冬芽形成期を測定した。開芽期と冬芽形成期はいずれも一山型の分布を示し、2次伸びする個体が60％あった。また、冬芽形成後に苗高成長が止まる個体と、形成後も成長を持続する個体が認められた。
2. F2からのDNA抽出と人工交配確認(後藤・北村)：F2の全個体450サンプルからDNAを抽出し、核SSR（４座）および葉緑体SSR（３座）の分析を行い、442個体がF2であることが確認された。一方、F2と確認できなかった8個体は、今後の分析実験から除外した。
3. 連鎖地図作成のためのマーカー探索（後藤・岩田）：一度に大量のSNP多型を検出できるRAD-seq法を導入して4種類の酵素を試した結果、EcoRIとBgIIIの組合せで、約73,000の候補SNP遺伝子座が検出され、そのうち1500遺伝子座以上で24個体全ての遺伝子型が決定できた。
4. ESTライブラリーを用いた候補遺伝子の検出（上野・石塚）：組織別に保存されたトドマツのRNAを用いて、雄花で8,554 Mb、雌花で10,945 Mb、葉で9,611 Mb、内樹皮で7,395 Mb、全体で36.5Gbのシーケンスを次世代シーケンサー（HiSeq2000）で解読した。
5. 野外のトドマツからのRNA抽出法の確立(久本・北村)：トドマツのRNA抽出に関しては、Plant RNA Isolation AidあるいはPVPを添加すれば良質の試料が得られることが確かめられた。季節ごとの発現遺伝子の定量を行うために構内の植栽木について樹冠上部、中部、下部、の３カ所から当年葉および一年葉の採取を週に一度、合計260検体の蓄積を行った。
6．標高別造林試験地の調査（後藤）：同じ標高域から採取した種苗を用いて4標高域に植栽し、植栽から45年以上が経過した標高別造林試験地の調査を行い、トドマツでは1100mの高標高域には生存個体がなくなるが、530mの標高域では生存率、成長ともに良く、自生標高に適応していることが確認された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
当初、連鎖地図の作成とQTLマッピングのマーカー作成にはもっと時間がかかると思われていたが、RAD-seq法を導入することにより一度に大量のSNPマーカーが検出できることが判明し、連鎖地図の精度とスピードが大幅に向上した。
組織別に保存されていたトドマツのRNAを長いリードを解読できるHiseq2000でシーケンスすることにより、大量のシーケンス情報を得ることに成功した。これにより、トドマツでのフェノロジーに関与すると推定される機能遺伝子の同定が可能になると思われる。
標高別造林試験地の調査結果を解析し、論文としてまとめることにより、トドマツが45年以上の長期にわたり、自生標高に遺伝的に適応していることを確かめられた。
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| 今後の研究の推進方策 |
既にRAD-seqについては4プレートの解析を外注済みであり、これらの結果をもとに連鎖地図の作成、QTLマッピングを行うための条件検討を行う。また、F2個体群の1年目、2年目のデータに加えて、3年目に取得する表現型データとSNP遺伝情報をもとに、実生の開芽、冬芽形成、成長パターンに関するQTLマッピングを行う。
シーケンス情報が得られたものについては、バイオインフォマティクスの手法を用いて機能推定を行い、トドマツの開花遺伝子など、フェノロジー関連遺伝子について検出する。また、毎週サンプリングし、-80℃で保存しているRNA分析用試料を解析し、これらの遺伝子がどの季節に発現しているかについて解析を行う。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
今年度は、次世代シーケンサーを用いてSSR等のマーカー作成を外注する予定であったが、RAD-seq法という新手法が開発され、一気に大量のSNPマーカーを開発するとともに、同時にタイピングができることが明らかになった。そこで、平成25年度はRAD-seq法に適した酵素種の選択に関する実験を行い、本格的なマーカー開発とSNPタイピングは来年度に行うことにした。
F2の実生苗についてDNAをプレートを準備し、全サンプルをRAD-seq法でSNPタイピングを行うことを平成26年8月までに行う。これらは次世代シーケンサーを用いて解析をするが、その際に次年度使用額を使用する。
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