| 研究課題/領域番号 |
25292160
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 研究機関 | 神戸大学 |
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研究代表者 |
三宅 正史 神戸大学, その他部局等, 教授 (60093316)
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| 研究分担者 |
原山 洋 神戸大学, (連合)農学研究科(研究院), 教授 (30281140)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | claudins / 着床前発生 / タイトジャンクション / 単為発生2倍体 / ブタ |
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| 研究概要 |
ブタ着床前胚には，claudin-1 mRNA (CLDN1)が，すべての着床前発生胚でリアルタイムPCRにより検出され，2細胞期に一時上昇して桑実胚では急増したが，後期胚盤胞では激減した。間接免疫蛍光法（IIF）により，4細胞まで細胞質に発現するが，その後胚ごとの分布相が多様で発生とともに核周囲または核内に移り，蛍光は弱くなった。WBにより，桑実胚までclaudin-1を多く発現するが，胚盤胞では大幅に減少した。CLDN4発現は4細胞まで低く，桑実胚以降に急増した。WBでは，claudin-4は着床前発生胚で常時発現していた。IIF解析では，桑実胚まで核周囲に明白な点状の局在を伴う細胞質分布を示し，胚盤胞形成とともに細胞間に集り，TJ構造を示す網状分布を呈した。
CLDN1のsiRNAを活性化直後に注入してノックダウン（KD）効果を調べたところ，卵割率が低下し，桑実胚以降の発生率は半減した。CLDN1-GFPを活性化直後に注入すると，2細胞から桑実胚まで，GFPの蛍光を胚全体の細胞質と細胞膜上に認めたが、胚盤胞ではGFP発現が一部の細胞に限られ，claudin-1の過剰発現による発生への影響もなかった。CLDN4のKDによっても卵割率の低下と発生遅延が見られ，桑実胚以降の発生率は著しく低下したが，CLDN4-GFP注入によるclaudin-4の過剰発現は着床前発生に影響しなかった。
以上の結果から，claudin-1はTJに直接関与しないが初期分割で役割を持つこと，claudin-4はTJの構造と機能に重要な役割を持つことが示唆された。
28 claudin familyの内，3，5-12, 14-20, 22, 23の18アイソフォームについて，RT-PCR用のプローブを設計し，現時点でclaudin-6, -7，のmRNA発現を桑実胚以降の胚で確認している。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
平成25年度は，claudin-1, -4について，1) 着床前発生期における発現性の変化についてIIFとWB法により明らかにし，2) 活性化直後の胚にsiRNA を注入することによるKD効果を，また、3) GFPを結合したCLDN mRNA注入によるclaudinの過剰発現が着床前発生に及ぼす影響について解析する計画であった。研究実績概要のとおり，これらすべての項目を明らかにし，TJの観点から，claudin-1は異所性の分布を示したが，siRNAによるKDは，その初期分割における役割を示唆していた。一方，claudin-4は，初期分割から胚に発現し，胚盤胞形成過程に至る前は細胞質性分布を示し，桑実胚からTJの形成が進むにしたがって典型的なTJ構造への局在を示すとともに，TJの機能が重要となる胚盤胞において，強く発現していた。これらの結果は，claudin-4が胚盤胞以降の発生において，TJ機能に持つ重要な役割を示唆するだけでなく，早期の胚分割期にも役割を持つことが示唆された。
次に，26年度実施計画の中で，その他のclaudin familyのmRNAレベルでの発現について，一部を明らかにできた。CLDN1, CLDN4の他に，マウスでの発現が知られているCLDN6，CLDN7 mRNAがブタ胚で発現されていることが明らかになった。
その他，将来的に，促進的／抑制的な発生条件のもとで，タンパク質レベルで発現しているclaudinの局在性などの変化と発生能力の関係を調べる計画であるが，現在，単糖（glucose, fructose）が存在する時期により，初期分割や胚盤胞への発生が受ける影響について詳細な基本データを集めている。
このように，25年度の実験は，計画を超えて進行していると判断している。
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| 今後の研究の推進方策 |
平成25年度には，にclaudin-1, -4はブタ着床前胚に発現し，claudin-1はTJの観点から異所性発現を示し，claudin-4はTJの配置に沿った機能的分布を示すことが明らかになった。さらに，全部で28のisoformの内，ブタ着床前胚での発現性が調べられていない25のclaudin family (1, 2, 4以外)で，ブタでのRT-PCR用プローブを18のisoformに対して設計を完了している。マウスで発現が確認されているCLDN6, 7に対してRT-PCRを行った結果，両mRNAのブタ着床前胚での発現が明らかになっている。
これらの結果を踏まえ，平成26年度以降はすでに胚での発現が明らかなCLDN1, 4, 6, 7 以外のCLDNについて，mRNAの発現を調べる。また，claudin-6, -7のタンパク質レベルでの発現について，IIF解析により局在性を明らかにする。また，その後，mRNAの発現が検出されたisoformも、抗体を入手できるものについては局在性を明らかにし，claudin-4とともに胚盤胞のTJに局在するisoformを明らかにするとともに，claudin-1のように，TJの観点から異所性の発現を示すisoformの有無を明らかにする計画である。
一方で，胚の培養条件によるブタ着床前胚におけるclaudin familyの発現性と胚発生能力の関係を調べるための基礎データとして，エネルギー基質である炭水化物，特に単糖のglucoseとfructoseが，ブタ着床前胚の発生に及ぼす影響について調べ，これらの糖の胚による利用性についての詳細なデータの集積を計画している。これらの基礎データを利用して，異なる培養条件を作成し，claudinの発現性饒変化と胚発生能力の関係を分析する方向へ，進展させる計画である。
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