| 研究課題/領域番号 |
25292177
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 研究機関 | 北海道大学 |
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研究代表者 |
稲葉 睦 北海道大学, (連合)獣医学研究科, 教授 (00183179)
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| 研究分担者 |
山盛 徹 北海道大学, (連合)獣医学研究科, 准教授 (00512675)
佐藤 耕太 北海道大学, (連合)獣医学研究科, 准教授 (50283974)
大塚 沙織 北海道大学, (連合)獣医学研究科, 助教 (10566152)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | 小胞体関連分解 / プロテアソーム / 膜蛋白質 / Derlin / ユビキチン / ERシャペロン |
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| 研究概要 |
1．R664X AE1を発現させたHEK細胞を用いて、プルダウン法／LC-MS/MS法により、これと相互作用するER関連分子としてp97/VCP、Derlin-1、Derlin-2、calnexin、FIT、CLPTM１等を同定した。
２．R664X AE1のERADにはDerlin-2が選択的に働く。その理由を探るために組換え蛋白質を用いた実験を行い、以下の結果を得た。１）ERからの逆行輸送に関与するとされるp97/VCPはSHPボックスをもつDerlin-1のC末端細胞質領域と結合する一方、Derlin-2のそれとの結合は全く認められず、Derlin-１とDerlin-2の作用機構が本質的に異なることが示唆された。２）Derlin-1とDerlin-2の膜内在性領域／C末端領域を組み換えたキメラ蛋白質Der1/2とDer2/1を用い、これらとR664X AE1が相互作用することを示した。３）R664X AE1のN-結合型糖鎖修飾変異体R664X/P661Sの分解に対するDerlins siRNAの影響を検討した結果、Derlin-1のsiRNAではR664X、R664X/P661Sのプロテアソーム分解が同等の影響を受けたのに対し、Derlin-2のsiRNAでは、主に糖鎖修飾型R664X/P661Sの分解が抑制された。これは、Derlin-2とcalnexinとの何らかの相互作用を示唆している。
３．ER膜上での分解過程を追跡できるよう、分子内に複数箇所の蛍光マーカーをもつR664X AE1を作製し、HEK細胞における発現を解析している。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
1．基質蛋白質R664Xと相互作用をもつER分子、あるいは細胞質分子群の同定に成果が得られ、さらに２－１）、２－２）各項に示すように、Derlin-1とDerlin-2がp97/VCPとの結合の有無で全く異なること、Derlin-2とERシャペロンcalnexinとの相互作用など、Derlin-2の選択性に関わるメカニズム解明の有用な端緒を得ることができ、本年度の最も重要な課題は一定レベルで達成できたと考える。一方、基質蛋白質とDerlinsとの相互作用自体は明確になったものの、作製した数種のキメラDerlinsは、それ自体が細胞内で不安定性であり、基質―Derlins間結合の仕組みの解明が遅れている。
２．基質蛋白質のER膜上での分解の視覚化は比較的困難であり、具体的成果に至っていない。これは、複数の蛍光マーカーを組み込むことによる基質蛋白質の性状変化等の問題が主たる要因である。
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| 今後の研究の推進方策 |
1．基質蛋白質分解の視覚化については、４ヶ月間、現計画を継続し、基質性状の大きな変化を生じない蛍光検出マーカーの可能性を検討する。ただし、安定な結果が得られる変異体作製が困難な場合は、プロテアソームと基質のER上相互作用を想定し、これらの生化学手法による検出に転換する。
２．平成25年度に得た諸知見をもとに、Derlin-2とR664X AE1の選択的相互作用のメカニズムを追求する。まず、これらと20S、あるいは26Sプロテアソームの直接結合についての検証を行い、さらにDerlins-基質複合体中に同定されたp97/VCP、calnexin等の関与を培養細胞発現系と試験管内再構成という異なる観点から検討する。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
経費のかかるアイソトープ標識メチオニンを用いた実験に代替法を用いた先行実験を行い、またプロテアソーム再構成系の作製とこれを用いた実験計画を次年度に繰り越したことによる。
次年度にアイソトープ、ならびにプロテアソーム再構成系を用いた実験を計画しており、これに経費を充てる。
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