網羅的リン酸化タンパク質解析のための３次元電気泳動イメージング技術の構築

2013 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 25293005
• 研究種目: 基盤研究(B)
• 研究機関: 広島大学
• 研究代表者: 木下 英司 広島大学, 医歯薬保健学研究院(薬), 准教授 (80304418)
• 研究期間 (年度): 2013-04-01 – 2017-03-31
• キーワード: フォスタグ / リン酸化 / 翻訳後修飾 / 電気泳動 / 生物物理化学

研究概要

申請者はこれまでに，リン酸基を特異的に捕捉する亜鉛錯体（フォスタグ）にアクリルアミド基を導入した誘導体を分子デバイスとして利用することで，リン酸親和性電気泳動法（フォスタグ SDS-PAGE）を開発している。本研究では，タンパク質の分離分析において活用される２次元電気泳動法を発展させ，独自に開発したフォスタグSDS-PAGEの原理を加えることで，電気泳動法における新しい３次元軸の構築を行う。これにより，深耕拡大する生体内の「リン酸化ワールドとシグナルネットワーク」を短時間（１回の電気泳動）で一網打尽に浮き彫りにするための新たな分離イメージング技術を創出する。当該年度では，リン酸化修飾と他の翻訳後修飾の同時検出を行うための３次元電気泳動解析の検証を試みた。以下に具体的な成果を記述する。
Wntシグナルの構成分子であるβ-カテニンは，プロテアソーム阻害剤存在下のHEK293細胞において，ポリユビキチン化され，１次元目の等電点電気泳動法と２次元目のSDS-PAGEで分子量の増加を検出できた。３次元目のフォスタグ SDS-PAGEを用いて展開すると，β-カテニンにはリン化酸状態の異なる少なくとも９つのリン酸化フォームが混在しており，そのうちの２つがユビキチン修飾に必須なリン酸化フォームであることが判明した。３次元展開で観察されたその２つのリン酸化フォームから分子量シフトを示す複数のスポットが派生しており，これらがユビキチン化タンパク質であることは，抗ユビキチン抗体によるウェスタン解析によって確認した。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

当該年度においては，リン酸化修飾と他の翻訳後修飾の同時検出を視野に入れた３次元解析データを蓄積することを目標にした。IEFとSDS-PAGEを組み合わせた２次元電気泳動法よりβ-カテニンを含むスポットを同定し，それらのスポットを含むゲルを短冊状に切り出した後，フォスタグSDS-PAGEにより３次元展開することに成功した。これにより，タンパク質のリン酸化とそれに関わるユビキンチン化修飾，また，その反応プロセスを浮き彫りにすることができた。すなわち，β-カテニンにはリン化酸状態の異なる少なくとも９つのリン酸化フォームが混在しており，そのうちの２つがユビキチン化修飾に必須なリン酸化フォームであることが判明し，リン酸化がユビキチン化の分子スイッチとして機能していることを証明することができた。
このように，分子全体の翻訳後修飾の動態の同時解析が可能になることを証明できたことで，本技術の有用性を立証し，今後の展開に期待できる。

今後の研究の推進方策

高次複合体プロテオームの質的・量的ダイナミクスの解明を視野に入れた３次元モニタリング法を確立する。リン酸化が関わる複合体形成など，複数のタンパク質分子のダイナミクスを同一ゲル内で解析が可能になることを証明することで，本技術の有用性を立証する。具体的には，ブルーネイティブ電気泳動（生体内の複合体を未変性で分離）とSDS-PAGE（分子量）を２次元展開の要素とし，３次元目にフォスタグSDS-PAGEを導入することも有用である。このように起点となる２次元平面ゲルを適宜応用することで，３次元電気泳動を高次複合体プロテオームのダイナミクス解析法として確立し，その有用性を立証する。同時に，分離・分解能向上のためのアクリルアミド結合型誘導体の新規合成を行い（例えば，アクリルアミド分子とフォスタ間にロングスペーサーを導入した誘導体など），改善されれば新たな分子デバイスとして顕在化させる。

次年度の研究費の使用計画

消耗品費や謝金に予定していた予算が削減でき，次年度使用額が生じた。
２年目はさらに研究が展開されるので，次年度使用額1,747,637円とH26年度予算を合わせて，消耗品費や謝金に大いに活用させて頂き，研究を効率よく進める予定である。

研究成果

• [雑誌論文] Identification of differentially expressed water-insoluble proteins during the encystment process of Colpoda cucullus by two-dimensional electrophoresis and LC-MS/MS analysis. (2014)
  • 著者名/発表者名: Sogame, Y., Kojima, K., Takeshita, T., Eiji Kinoshita, and Matsuoka, T.
  • 雑誌名: J. Eukaryot. Microbiol. 巻: 61 ページ: 51-60
  • DOI: doi: 10.1111/jeu.12086.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Profiling of protein thiophosphorylation by Phos-tag affinity electrophoresis: evaluation of adenosine 5′-O-(3-thiotriphosphate) as a phosphoryl donor in protein kinase reactions. (2014)
  • 著者名/発表者名: Eiji Kinoshita, Kinoshita-Kikuta, E., Shiba, A., Edahiro, K., Inoue, Y., Yamamoto, K., Yoshida, M., and Koike, T.
  • 雑誌名: Proteomics 巻: 14 ページ: 668-679
  • DOI: doi: 10.1002/pmic.201300533.
  • 査読あり
• [雑誌論文] A Phos-tag-based magnetic-bead method for rapid and selective separation of phosphorylated biomolecules. (2013)
  • 著者名/発表者名: Tsunehiro, M., Meki, Y., Matsuoka, K., Kinoshita-Kikuta, E., Eiji Kinoshita, and Koike, T.
  • 雑誌名: J. Chromatogr. B. Analyt. Technol. Biomed. Life. Sci. 巻: 925 ページ: 86-94
  • DOI: doi: 10.1016/j.jchromb.2013.02.039.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Sandwich assay for phosphorylation of protein multiplexes by using antibodies and Phos-tag. (2013)
  • 著者名/発表者名: Eiji Kinoshita, Kinoshita-Kikuta, E., and Koike, T.
  • 雑誌名: Anal. Biochem. 巻: 438 ページ: 104-106
  • DOI: doi: 10.1016/j.ab.2013.03.029.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Excystment-dependent alteration of protein expression in terrestrial ciliate Colpoda cucullus. (2013)
  • 著者名/発表者名: Sogame, Y., Kojima, K., Takeshita, T., Eiji Kinoshita, Funadani, R., and Matsuoka, T.
  • 雑誌名: Microbes Environ. 巻: 28 ページ: 388-390
  • 査読あり
• [雑誌論文] Increase in Lipophilicity of Enalaprilat by Complexation with Copper(II) or Zinc(II) Ions. (2013)
  • 著者名/発表者名: Fujioka, H., Hieda, Y., Kuramoto, Y, Konishi, K., Kinoshita-Kikuta, E., Eiji Kinoshita, and Koike T.
  • 雑誌名: Yakugaku Zasshi 巻: 33 ページ: 1135-1141
  • 査読あり
• [雑誌論文] タンパク質リン酸化修飾の高感度検出法と新しいオミクス技術としての展開． (2013)
  • 著者名/発表者名: 木下英司，木下恵美子，小池透
  • 雑誌名: 生化学 巻: 85 ページ: 447-552
  • 査読あり
• [雑誌論文] Phos-tag-based microarray techniques advance phosphoproteomics. (2013)
  • 著者名/発表者名: Eiji Kinoshita, Kinoshita-Kikuta, E., and Koike, T.
  • 雑誌名: J. Proteomics Bioinform. 巻: S6 ページ: 008
  • DOI: doi: 10.4172/jpb.S6-008
  • 査読あり
• [学会発表] タンパク質リン酸化修飾の高感度検出法と新しいオミクス技術としての展開
  • 著者名/発表者名: 木下英司
  • 学会等名: 愛媛大学プロテオサイエンスセンター & JHUPO サテライト ジョイントシンポジウム（第２回）
  • 発表場所: 愛媛大学総合情報メディアセンター，松山市
  • 招待講演
• [学会発表] トップダウンリン酸化プロテオミクスを指向したアフィニティー磁気ビーズの創出
  • 著者名/発表者名: 木下英司
  • 学会等名: 「修飾シグナル病」 第３回領域推進会議
  • 発表場所: 東京大学医科学研究所，東京
• [学会発表] 次世代シグナル伝達研究のためのフォスタグテクノロジー
  • 著者名/発表者名: 木下英司
  • 学会等名: 第86回日本生化学大会
  • 発表場所: パシフィコ横浜，横浜市
• [学会発表] Phos-tag Biotin as an on-demand tool for study on protein phosphorylome
  • 著者名/発表者名: Eiji Kinoshita, Emiko Kinoshita-Kikuta, and Tohru Koike
  • 学会等名: HUPO 12th Annual World Congress (HUPO2013)
  • 発表場所: パシフィコ横浜，横浜市
• [学会発表] Phosphorylation profiling of MAPK signaling cascade proteins by using neutral Phos-tag SDS-PAGE
  • 著者名/発表者名: Emiko Kinoshita-Kikuta, Eiji Kinoshita, and Tohru Koike
  • 学会等名: HUPO 12th Annual World Congress (HUPO2013)
  • 発表場所: パシフィコ横浜，横浜市
• [学会発表] Rapid and selective separation of phosphorylated biomolecules by using a Phos-tag-based magneticbead method
  • 著者名/発表者名: Masaya Tsunehiro, Yuma Meki, Emiko Kinoshita-Kikuta, Eiji Kinoshita, and Tohru Koike
  • 学会等名: HUPO 12th Annual World Congress (HUPO2013)
  • 発表場所: パシフィコ横浜，横浜市
• [学会発表] Quantitative analysis of effects of pH on the stability of His- and Asp-phosphoproteins in bacterial two-component system by using phosphate-affinity SDS-PAGE
  • 著者名/発表者名: Akio Shiba, Keisuke Edahiro, Emiko Kinoshita-Kikuta, Eiji Kinoshita, and Tohru Koike
  • 学会等名: HUPO 12th Annual World Congress (HUPO2013)
  • 発表場所: パシフィコ横浜，横浜市
• [学会発表] Quantitative analysis of the phosphorylation state of a hybrid histidine kinase in bacterial twocomponent system by using phosphate-affinity SDS-PAGE
  • 著者名/発表者名: Keisuke Edahiro, Akio Shiba, Emiko Kinoshita-Kikuta, Yuki Inoue, Eiji Kinoshita, and Tohru Koike
  • 学会等名: HUPO 12th Annual World Congress (HUPO2013)
  • 発表場所: パシフィコ横浜，横浜市
• [学会発表] Phos-tag-Based Technological Advances for Studies on Signal Transductions in the Coming Generation
  • 著者名/発表者名: Eiji Kinoshita
  • 学会等名: HUPO 12th Annual World Congress (HUPO2013), Luncheon Seminar
  • 発表場所: パシフィコ横浜，横浜市
  • 招待講演
• [学会発表] Ras/MAPK症候群および孤発性癌で認められるMEK遺伝子変異体の 異常活性化機構と疾患発症メカニズムの解明
  • 著者名/発表者名: 久保田 裕二，木下 英司，武川 睦寛
  • 学会等名: 第64回日本電気泳動学会総会
  • 発表場所: 東北福祉大学ステーションキャンパス，仙台市
• [学会発表] 迅速かつ簡便にリン酸化生体分子を分離精製するための Phos-tag磁気ビーズの開発
  • 著者名/発表者名: 常弘 昌弥, 目木 勇馬, 木下 恵美子，木下 英司，小池 透
  • 学会等名: 第64回日本電気泳動学会総会
  • 発表場所: 東北福祉大学ステーションキャンパス，仙台市
• [学会発表] ヒスチジン，アスパラギン酸のタンパク質リン酸化解析におけるチオリン酸基供与体（ATP-gS）利用の 有用性の検討
  • 著者名/発表者名: 芝 晃生，枝廣 圭祐，井上 裕希，木下 恵美子， 木下 英司，小池 透
  • 学会等名: 第64回日本電気泳動学会総会
  • 発表場所: 東北福祉大学ステーションキャンパス，仙台市
• [学会発表] ハイブリッド型ヒスチジンキナーゼにおけるリン酸基転移反応の制御機構解析
  • 著者名/発表者名: 枝廣 圭祐，芝 晃生，井上 裕希，木下 恵美子， 木下 英司，小池 透
  • 学会等名: 第64回日本電気泳動学会総会
  • 発表場所: 東北福祉大学ステーションキャンパス，仙台市
• [学会発表] 近接Phos-tagゲルを用いたリン酸化タンパク質の電気泳動法
  • 著者名/発表者名: 目木 勇馬，木下 恵美子，木下 英司，小池 透
  • 学会等名: 第64回日本電気泳動学会総会
  • 発表場所: 東北福祉大学ステーションキャンパス，仙台市
• [学会発表] 迅速かつ簡便にリン酸化生体分子を分離精製するためのPhos-tag磁気ビーズの創製
  • 著者名/発表者名: 常弘昌弥, 目木勇馬, 木下恵美子，木下英司, 小池 透
  • 学会等名: 修飾シグナル病 第３回 公開シンポジウム
  • 発表場所: 東京大学医科学研究所，東京
• [学会発表] ハイブリッド型ヒスチジンキナーゼにおける リン酸基転移反応の制御機構
  • 著者名/発表者名: 枝廣圭祐, 芝 晃生, 井上裕希，木下恵美子, 木下英司，小池 透
  • 学会等名: 修飾シグナル病 第３回 公開シンポジウム
  • 発表場所: 東京大学医科学研究所，東京
• [学会発表] Highly Sensitive Detection of Protein Phosphorylation by Phos-tag Technology
  • 著者名/発表者名: Eiji Kinoshita
  • 学会等名: 1st HiHA International Symposium
  • 発表場所: Hiroshima University, Higashi-Hiroshima
  • 招待講演
• [学会発表] Phos-tag を用いた解析技術
  • 著者名/発表者名: 木下英司
  • 学会等名: 大阪大学蛋白質研究所セミナー ～キナーゼ・シグナリング研究の進展 ～
  • 発表場所: 大阪大学蛋白質研究所
  • 招待講演
• [学会発表] 亜鉛サイクレン磁気ビーズを用いたチオール化合物の精製
  • 著者名/発表者名: 藤岡晴人，稗田雄三，常弘昌弥，木下恵美子，木下英司，小池 透
  • 学会等名: 日本薬学会第134年会
  • 発表場所: 熊本市総合体育館，熊本市
• [備考] 広島大学大学院医歯薬保健学研究院医薬分子機能科学研究室
  • URL: http://home.hiroshima-u.ac.jp/tkoike/index.html
• [備考] 新学術領域研究『修飾シグナル』
  • URL: http://shushoku-signal.com/soshiki/kobo/18kinoshita.html