研究課題
申請者はこれまでに,リン酸基を特異的に捕捉する亜鉛錯体(フォスタグ)にアクリルアミド基を導入した誘導体を分子デバイスとして利用することで,リン酸親和性電気泳動法(フォスタグSDS-PAGE)を開発している。本研究では,タンパク質の分離分析において活用される2次元電気泳動法を発展させ,独自に開発したフォスタグSDS-PAGEの原理を加えることで,電気泳動法における新しい3次元軸の構築を行う。これにより,深耕拡大する生体内の「リン酸化ワールドとシグナルネットワーク」を短時間(1回の電気泳動)で一網打尽に浮き彫りにするための新たな分離イメージング技術を創出する。当該年度においては,高次複合体プロテオームの質的・量的ダイナミクスの解明を視野に入れた3次元モニタリング法の確立を目指した。リン酸化が関わる複合体形成など,複数のタンパク質分子のダイナミクスを同一ゲル内で解析が可能になることを証明することで,本技術の有用性を立証した。具体的には,ブルーネイティブ電気泳動(生体内の複合体を未変性で分離)とSDS-PAGE(分子量で分離)を2次元展開の要素とし,3次元展目にフォスタグSDS-PAGEを導入することでリン酸化が関わる複合体形成など,複数のタンパク質分子のダイナミクスを同一ゲル内で解析が可能となった。また,タンパク質を検出する際に,ウェスタンブロットにおけるフォスタグゲルからの標的タンパク質の転写効率を改善させる必要が生じた。セミドライ法では,フォスタグゲルのEDTA処理により改善された。ウェットタンク法では,通常のゲルとフォスタグゲルの差異はないが,ゲルに残存するタンパク質バンドが認められた場合,転写緩衝液に0.1% w/w SDSを添加することで,ゲルからの溶出量が増大することが判明した。
2: おおむね順調に進展している
当該年度においては,当初の予定どおり,高次複合体プロテオームの質的・量的ダイナミクスの解明を視野に入れた3次元モニタリング法の確立を目指した。その結果,リン酸化が関わる複合体形成など,複数のタンパク質分子のダイナミクスを同一ゲル内で解析が可能になることを証明することで,本技術の有用性を立証した。具体的には,ブルーネイティブ電気泳動(生体内の複合体を未変性で分離)とSDS-PAGE(分子量で分離)を2次元展開の要素とし,3次元展目にフォスタグSDS-PAGEを導入することでリン酸化が関わる複合体形成など,複数のタンパク質分子のダイナミクスを同一ゲル内で解析が可能となったので,今後の展開に期待できる。さらには,フォスタグゲルからのタンパク質の転写効率が低い原因を明らかにし,それに基づいた改善策を確立することができた。本成果が,フォスタグSDS-PAGEを利用するすべての研究者にとって,最適な転写方法を選択するための有用なガイドラインになることが期待され,今後の展開にも活かされる。
高次複合体プロテオームの質的・量的ダイナミクスの解明を行うための3次元電気泳動解析(この計画は前年度より持ち越されたものであり,今年度も継続して行う予定である。)高次複合体プロテオームの質的・量的ダイナミクスの解明を視野に入れた3次元モニタリング法を確立する。リン酸化が関わる複合体形成など,複数のタンパク質分子のダイナミクスを同一ゲル内で解析が可能になることを証明することで,本技術の有用性を立証する。次元蛍光ディファレンシャル解析法の確立3次元蛍光ディファレンシャル解析法の確立を視野に入れたリン酸化ディファレンシャルデータを蓄積する。3次元展開ゲルにおいて,生理的・病理的状態の異なるサンプル間のリン酸化ディファレンシャル解析を行い,その検出の感度や頻度に関するデータを蓄積し,3次元蛍光ディファレンシャルイメージングの有用性を立証する。
旅費や謝金に予定していた予算が削減でき,次年度使用額が生じた。
3年目はさらに研究が展開されるので,次年度使用額1,141,671円とH27年度予算を合わせて,旅費や謝金に大いに活用させていただき, 研究を効率よく進める予定である。
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すべて 雑誌論文 (11件) (うち査読あり 11件、 謝辞記載あり 11件、 オープンアクセス 2件) 学会発表 (8件) (うち招待講演 4件) 備考 (1件)
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