研究課題
基盤研究(B)
本研究課題では、血中や中枢神経系（脳内）でのコレステロール代謝平衡を調節しているヘリックス型アポリポタンパク質であるアポA-IとアポEについて、１．HDL非結合-結合型構造間の動的平衡コンフォメーションに関する物理化学的解析、２．ABCトランスポータータンパク質との相互作用を介したHDL形成過程に関する物理化学的・細胞生物学的解析、３．遺伝子変異や多型によるタンパク質高次構造変化とコレステロール代謝調節機能異常・欠損との構造作用相関解析、などの横断的・統合的解析を行うことで、アポリポタンパク質によるHDL産生・代謝調節機構の物理化学的基盤を解明するとともに、コレステロール代謝制御システムの破綻によって引き起こされる脂質異常症やアミロイドーシス、神経変性疾患などに対する新たな予防・治療法開発のための科学的基盤構築を目指している。平成25年度は、アポA-Iによる血漿HDL産生・代謝制御機構の解明を目的として、アポA-I-ABCA1相互作用によるHDL形成過程の１分子リアルタイム観測法開発に向けた部位特異的システイン残基導入・環境感受性蛍光プローブ標識化アポA-I分子を設計し、細胞からのHDL形成過程がアポA-I分子の蛍光特性変化から簡便に検出できることを確認した。また、アミロイドーシス変異によるアポA-Iアミロイド線維形成のメカニズム解明を目的として、組織沈着領域であるN末フラグメントのアミロイド線維形成性や線維形態の評価などを行った。さらに、アポEによる脳内HDL代謝制御機構の解明を目的として、アポA-Iの場合と同様な部位特異的システイン残基導入・環境感受性蛍光プローブ標識法の適用によるアポEアイソフォームの分子間会合体とHDL結合構造間での動的平衡コンフォメーション解析を行った。この際、分子間会合性の影響も考慮する目的で、単量体化C末領域変異を導入したアポEアイソフォームの設計・作製も同時に進めた。
2: おおむね順調に進展している
本研究課題では、血中や脳内でのコレステロール輸送を担うHDLが、アポA-IやアポEなどのアポリポタンパク質によって産生・代謝調節を受ける機構の物理化学的・細胞生物学的解明を行うとともに、代謝調節の異常によって起こる脂質異常症やアミロイドーシス、神経変性疾患などに対する新たな予防・治療法開発のための科学的基盤構築を目指している。平成25年度は、まず、アポA-Iによる血漿HDL産生反応に関し、HDL形成過程においてアポA-I分子内のN末ヘリックスバンドルが束状に閉じた構造からほどけて広がった構造へと変化する点に着目し、環境感受性蛍光プローブ標識法をこのアポA-I高次構造変化の検出に応用することで、生細胞におけるHDL形成過程のリアルタイム観測法の開発を行った。この手法により、従来の細胞外排出コレステロール量測定という手法では不可能であった、HDL形成過程の１分子レベルでの可視化解析が可能となる。また、アポA-Iの遺伝子変異による疾患発症の機構解明として、典型的なアミロイドーシス変異として知られているIowa（G26R)をまずターゲットとし、その全長変異体や組織沈着領域であるN末フラグメントのアミロイド線維形成性や線維形態の評価を行い、G26R変異が全長タンパク質の構造不安定化とN末フラグメントの線維形成促進という二重の効果をもつことを見出した。さらに、脳内でのHDL形成を担うアポEに関しても、部位特異的システイン残基導入・環境感受性蛍光プローブ標識法によるアイソフォームの分子間会合体とHDL結合構造間での動的平衡コンフォメーション解析を進め、脂質粒子結合に伴うN末ヘリックスバンドル構造変化のリアルタイム観測に成功している（投稿準備中）。以上のように、当初の研究計画に対しておおむね順調に進展している。
平成25年度に開発したHDL形成リアルタイム観測のための蛍光プローブ標識アポA-Iを用いて、細胞内でのHDL形成をin situで観察する。これにより、細胞内でのHDL形成過程の直接検出や細胞内因子によるHDL形成制御機構の解析を行うとともに、簡便なHDL産生活性評価法としての蛍光プローブ標識アポA-Iの有用性を検証する。また、in vitroで強い線維形成性が見られたアミロイドーシス変異アポA-Iについて、オリゴマーや線維などの凝集状態の差異を識別・検出が可能なアポA-Iコンフォメーション認識抗体の作成に着手することで、組織・臓器などの生体内環境におけるアポA-Iアミロイド線維形成・組織障害機構の解明を目指す。さらに、アポEアイソフォーム特異的脳内HDL産生・コレステロール輸送機能について、平成26年度は細胞表面糖鎖の役割に着目し、ヘパラン硫酸やコンドロイチン硫酸を欠損した細胞株や糖鎖結合部位を改変したアポEアイソフォーム変異体を用いて、アポEによる細胞からのHDLコレステロール産生作用や細胞への接着・取り込み過程などを比較評価することで、アイソフォーム特異的な脳内HDL産生・コレステロール輸送機能の分子メカニズムを、アポEと細胞表面糖鎖との相互作用の観点から解析する。
研究の進展状況に応じて、平成25年度に当初購入を予定していた物品のうち高速液体クロマトグラフの購入を行わなかったため、次年度使用額が生じた。平成26年度の研究進展状況をみながら、別種類の機器の購入を検討する予定である。
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