| 研究課題/領域番号 |
25293009
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 研究機関 | 慶應義塾大学 |
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研究代表者 |
金澤 秀子 慶應義塾大学, 薬学部, 教授 (10240996)
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| 研究分担者 |
綾野 絵理 慶應義塾大学, 薬学部, 研究員 (10424102)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | バイオマーカー / 機能性高分子 / RNA / タンパク分離 |
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| 研究概要 |
タンパク選別分離のための分子識別能構築と吸脱着評価：
疾患マーカーとなるタンパク分離への応用に向けて選択性の向上のための高機能表面を設計することを目的に検討した。タンパクの吸脱着には高分子層の厚みが大きく影響することを確認している。特定の分子を認識する官能基の導入により，選択的に分子を識別する高分子の設計が可能である。これまで温度応答性高分子poly(N-isopropylacrylamide) (PNIPAAm)にプロリンを基盤とするアミノ酸誘導体を共重合することにより芳香族アミノ酸を含むタンパクの選択性が向上することを報告している。本研究課題では分子認識部位として高分子鎖中にフェニルアラニンやトリプトファンを基盤とするアミノ酸誘導体を導入することにより，選択性の向上を図り，効率の良い分離システムの設計について検討した。カラムあたりのタンパク精製量の向上について検討するため，アイソトープラベルしたタンパクを分離担体に担持させた後，温度降下により担体表面に修飾したPNIPAAmを伸展させ，タンパクを溶出させ回収率を求めた。PNIPAAm鎖中に疎水性物質であるbutyl methacrylate (BMA)及びカチオン性のN,N-dimethylaminopropyl acrylamide (DMAPAAm)を導入した高分子層を持つシリカゲルビーズ担体を作製した。PNIPAAmにBMAを導入したカラムでは，モデルタンパクとして用いたヒト血清アルブミン(HSA)は保持されずに低分子薬物との分離が可能であった。PNIPAAmにDMAPAAmを導入したカラムで分析を行ったところ, 温度を高くするとHSAは保持された。保持されたHSAは, 生理食塩水を流すと溶出させ回収することが可能であった。同様の条件で，クロラミンT法を用いてHSAをヨウ素125で標識し，HSAの回収率を求めたところ80％以上の高い回収率が得られた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本年度は，PNIPAAmに疎水性物質及び荷電性物質を共重合した機能性高分子を合成し，温度により疎水性相互作用と静電的相互作用を制御可能な分離担体を構築した。新規分離システムを利用したタンパク質の生理活性評価と分離について検討した結果, 温度変化による充填剤表面の親水/疎水及び荷電/非荷電変化を利用することによって, 従来の固相抽出法とは異なる温和な条件でタンパクなどの生体高分子を精製可能であることが示唆された。
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| 今後の研究の推進方策 |
RNAタンパク複合体精製のためのアフィニティークロマトグラフィー技術の確立
RNP精製を可能にする環境応答型アフィニティークロマトグラフィーを確立する。200-300塩基組成の7SKRNA等をモデルRNAとして使用しRNP分離精製について検討する。
アフィニティー精製用バイオセパレーション技術確立
生理活性タンパクについて活性を損なわずに大量に分取可能なバイオセパレーションシステムの実現を図る。本システムでは，リガンドに結合したタンパクを溶出させるために従来法で必要であったｐＨや塩濃度等の過酷な溶媒条件を用いずに，高分子の構造変化により生理活性タンパクを脱着させるため，生理機能を損なわずに分離精製が可能となる。タンパクの不可逆的な会合凝集・変性を防ぎ，回収率を向上させ，溶媒や廃液のコストを削減し，安全性と信頼性の高い方法を確立する。複数のリガンドを用い分離条件の最適化と回収率の向上について検討する。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
研究は当初の計画どおり、ほぼ順調に進んでいるが、RNAタンパク複合体精製のためのアフィニティークロマトグラフィーについて、モデルRNAやアプタマーでの検討を行うことができなかったため、次年度の課題となった。RNAやアプタマーは高額なため、そのための研究費も次年度に繰り越すこととした。
RNAタンパク複合体精製のためのアフィニティークロマトグラフィー技術の確立のために200-300塩基組成の7SKRNA等をモデルRNAとして使用しRNP分離精製について検討する。
さらに特異的結合性という特性から，RNAアプタマーを用いる。アプタマーは分子認識素子としての利用が期待されており，修飾も容易である。PNIPAAm修飾した担体表面にストレプトアビジンを固定化し，ビオチン基を導入したRNA（特異的リガンド）を結合する。
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