| 研究課題/領域番号 |
25293013
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 研究機関 | 奈良先端科学技術大学院大学 |
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研究代表者 |
伊東 広 奈良先端科学技術大学院大学, バイオサイエンス研究科, 教授 (10183005)
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| 研究分担者 |
小林 哲夫 奈良先端科学技術大学院大学, バイオサイエンス研究科, 助教 (80433994)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | シグナル伝達 / GPCR / Gタンパク質 |
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| 研究概要 |
細胞膜を七回貫通する特徴を有するGタンパク質共役受容体（G protein-coupled receptor, GPCR）はホルモンや神経伝達物質など数多くの細胞外シグナルにより活性化されシグナルを細胞内へ伝達する。本研究では新しいファミリーとして見出されたadhesion GPCRに属するGPR56とLatrophilin1の活性制御機構と生理機能の解明、そして新奇Gタンパク質調節分子Ric-8のGPCRシグナルにおける役割の解明を目指している。本年度の実績の概要は以下の通りである。（１）ヒトGPR56に対するモノクローナル抗体をいくつも作成し、そのうちヒトグリア腫細胞の遊走を阻害する３種類の抗体が細胞内カルシウム応答をGq依存性に起こすことを見出した。これら３つの抗体がGPR56の細胞外ドメイン（ECD）のうちN末側100アミノ酸とC末側100アミノ酸をそれぞれ認識することが欠失変異体を用いて明らかとなった。また、アゴニスト様に働く抗体がGPR56の細胞ドメインと細胞内ドメインの相互作用を強めることが共免疫沈降実験から判明した。（２）GPR56-ECDとLatrophilin1の膜貫通ドメインからなる複合体がGABA抑制性ニューロンに存在する可能性を示す免疫染色データが初代培養神経細胞と脳切片を用いて得られた。（３）心筋細胞の拍動を増強するβアドレナリン受容体を介するシグナルがGq共役型受容体の持続的な活性化により減弱される。心筋細胞および繊維芽細胞で持続的なGqシグナルによりユビキチン化の増加とGsαの発現量の低下が認められ、その効果がRic-8Bの過剰発現で抑制されることが判明した。（４）ショウジョウバエのRic-8がGタンパク質αサブユニットの一つであるCtaの膜局在化に必要であることが原腸陥入不全を示すRic-8変異体を用いた解析より明らかとなった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
GPR56を認識し、アゴニスト様に働く抗体と働かない抗体が得られ、それらの抗体を用いた詳細なGPR56の活性制御機構の解析が進んでいる。共発現系で認められたGPR56とLatrophilin1からなる複合体が脳内のどの細胞で存在するかを脳切片と初代培養神経細胞を用いて解析した結果、GABA抑制性ニューロンでの両者の発現が認められた。今後、この神経細胞に絞った解析が可能となった。Ric-8Bが心筋細胞におけるGsとGqを介した２つのシグナル伝達系を結びつける分子として働いていること、そしてユビキチン化と密接に関連することが判明した。GsおよびRic-8Bのそれぞれ、あるいは両者と相互作用しユビキチン化修飾に関連するいくつかの候補分子がプロテオーム解析から見出された。
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| 今後の研究の推進方策 |
先にGPR56の内在性リガンド候補として同定したレプリカンのリコンビナントタンパク質の調製に成功しているので、直接的なGPR56との結合を確認するとともにGPR56モノクローナル抗体とレプリカンが競合するか検討しレプリカンの結合部位の絞り込みを行う。GABA抑制性ニューロンのマーカー遺伝子であるGAD67のプロモーター下流にGFPを繋いだノックインマウスからGFPを指標としてGABAニューロンを単離し、その細胞でのGPR56とLatrophilin1からなるキメラ受容体の存在の確認と機能の解明を進めていく。Mass解析からRic-8とGsαと相互作用することが示唆されたユビキチン修飾酵素のcDNAを単離し、相互作用を確認するとともに酵素活性不活化変異体を作成し、細胞内のグローバルなユビキチン化やGsαのユビキチン化に対する効果を検討する。Gタンパク質αサブユニットの脂質修飾に対するRic-8の効果を細胞メタボリックラベルと蛍光化学修飾を利用したClick assayによる検討する。
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