| 研究課題/領域番号 |
25293030
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 研究機関 | 独立行政法人産業技術総合研究所 |
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研究代表者 |
小松 康雄 独立行政法人産業技術総合研究所, 生物プロセス研究部門, 研究グループ長 (30271670)
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| 研究分担者 |
南川 典昭 徳島大学, ヘルスバイオサイエンス研究部, 教授 (40209820)
平野 悠 独立行政法人産業技術総合研究所, 生物プロセス研究部門, 主任研究員 (70415735)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | オリゴヌクレオチド / アンチセンス / miRNA / siRNA |
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| 研究概要 |
１）2本鎖RNAの末端部位での架橋：2本鎖RNA(20 mer)の向い合う5’と3’末端同士を2価のアミノ基またはアミノオキシ基の架橋剤（クロスリンカー）で化学的に結合させるために、RNAの5’末端に5’-アミダイトRNAを用いて5’-5’結合を有するRNAを合成した。続いて、2本鎖RNAを過ヨウ素酸酸化し、過剰の過ヨウ素酸を除去した後、クロスリンカーによる連結を試みた。反応の結果、2本鎖RNA間が連結されたことを確認した。これは、5’-5’結合RNAの5'末端と相補鎖の3’末端がともに酸化されてアルデヒド基を生成し、それらがクロスリンカーで架橋されたことを意味しており、新しいタイプの架橋化反応が同手法で可能であることを確認した。
２）2本鎖RNAの内部配列での架橋：相補的なRNAまたは2’-OMe化RNAの中央にデオキシウリジン(dU)を有するRNAを合成後、ウラシルDNAグリコシラーゼ(UDG)で処理し、生じたAP site間をクロスリンカーで架橋可能かどうかを調べた。反応の結果、RNAおよび2’-OMe化RNAのいずれの場合でも架橋体が得られることを確認した。
３）4’-Thio-2’-OMe化RNAの合成：4’-Thio-2’-OMe化RNAの合成に用いるため、４種類の4’-thio-2’-OMe化RNA（A, G, C, U）モノマーユニットをそれぞれ合成した。
４）細胞アッセイシステムの構築：合成したアンチmiRNAオリゴ（AMO）のmiRNA抑制活性を細胞内で評価するために、ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子の停止コドンの下流にmiRNA(miR-21)の結合配列を導入し、miRNA検出ベクターを構築した。続いてこのべクターを培養細胞に導入し、24時間後にルシフェラーゼ活性を測定したところ、細胞内のmiR-21によってウミシイタケルシフェラーゼの活性が抑制されることを確認した。また、この評価系を利用して市販のAMOのmiR-21抑制効果を確認した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
RNAの末端部位と、RNAおよび2'-OMe-RNAそれぞれの2本鎖の配列内部における架橋化反応を行い、いずれも反応が進行することを明らかにした。また、細胞アッセイシステムの構築も完了したことから概ね計画通りに研究は推移した。
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| 今後の研究の推進方策 |
初年度に開発したRNAならびに2'-OMe-RNA2本鎖の架橋化反応を駆使し、種々の架橋型RNA構造体を構築する。続いて、構築した架橋型RNA構造体を用いてmiR-21に対する熱的安定性を測定するとともにmiR-21の細胞内抑制効果を評価して、物理化学的結果と細胞内活性の相関性を調べる。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
今年度の予定では、4’-thio-2’-OMe化RNAの架橋化反応も検討する予定であったが、RNAと2'-OMe化RNAの架橋反応を詳細に解析する必要性が生じ、4'-thio-2'-OMe体の解析に関しては次年度に行うこととした。これによりRNAの精製頻度が計画よりも減少したため、精製作業などのために想定していた実験補助員の雇用を次年度に持ち越すこととした。
2’-OMe化RNAおよび4’-thio-2’-OMe化RNAの合成に必要な消耗品類を購入する。さらに、2’-OMe化RNAに関しては民間の受託合成を活用することで、解析のスピードを速める。種々の架橋化RNA構造体それぞれのmiRNA抑制活性を細胞を用いて評価する。そのため、細胞解析に用いる消耗品類の購入を進める。
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