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2013 年度 実績報告書

中心体周囲物質から見た神経変性症原因分子とHAP1の形態機能の関係解明

研究課題

研究課題/領域番号 25293045
研究種目

基盤研究(B)

研究機関山口大学

研究代表者

篠田 晃  山口大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (40192108)

研究分担者 早坂 直人  山口大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (80368290)
藤永 竜太郎  山口大学, 医学(系)研究科(研究院), 講師 (30335723)
柳井 章江  山口大学, 医学(系)研究科(研究院), 講師 (20284854)
國分 啓司  山口大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (00432740)
研究期間 (年度) 2013-04-01 – 2016-03-31
キーワード斑点小体 / 脳 / 培養細胞 / アタキシン / アンドロゲン受容体
研究概要

1. PCM1等中心体関連分子や神経変性症原因分子huntingtin(Htt)、ataxin3(ATX3)について、培養細胞(静止期)内での局在性を調べると、PCM1等中心体関連分子及びHttは中心体周囲に集積が見られた。ATX3は細胞質に散在性に広がっていた。培養細胞(静止期)内へSTB/HAP1cDNAを強制発現させると中心体周囲に集積していた内因性のPCM1やATX3はSTB/HAP1に局在を示すようになった。Httは散在性に細胞質に広がった。
2. PCM1についてクローニングを行い、GFP-PCM1cDNAプラスミドを作成した。HttのTX-PCM1cDNAプラスミドのクローニングも終了している。ARはGFP-PCM1cDNAプラスミドを作成済みであり、ステロイドフリーでは細胞質にあり、DHT投与では核内移行が見られた。
3. ウィスター雄成獣ラット脳内でPCM1の免疫組織化学染色を行った。その結果、STB/HAP1が発現する領域(特に視床下部、内側視索前野、内側扁桃体等)ではPCM1陽性構造は、神経細胞内で多くが細胞質に点状構造の局在性を示し、STB/HAP1を発現しない領域(線条体、視床等)では、散在性に細胞質に広がっていた。Httはいずれの領域でも細胞質に散在性に広がっていた。さらに脳内でPCM1とSTB/HAP1との蛍光二重染色を行うとPCM1は神経細胞質内でSTB/HAP1に局在していることがわかった。
4. STB/HAP1を発現する細胞株と発現しない細胞株で中心体関連分子等とHAP1/STBおよび神経変性症原因分子Htt、AR、ataxin3等との形態学的関係のデータ収集の準備を始めた。
5. 細胞周期の実験系については、形態学的な方法とDNAアッセイの予備実験を開始した。なお、HAP1を導入しても細胞分裂は進行することを予備データとして得ている。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

25年度の交付申請の段階での以下の計画内容について、下記の状況からおおむね順調に進んでいると判断した。(1)培養細胞(静止期)内へのSTB/HAP1発現がもたらす上記中心体関連分子の局在変化のデータの収集と解析を行う予定であったが,これらについてはほぼ終了している。(2)PCM1を含めて、内因性の種々の中心体関連分子でSTB/HAP1発現によって変化を来すものがあった場合、それらについてクローニングを行い、GFP-PCM1cDNAなどプラスミドを作成する予定であったが、PCM1、Htt、ARのcDNAクローニングは終わっている。(3)ウィスター雄ラット脳内でのSTB/HAP1が発現する領域としない領域での上記中心体関連分子とSTB/HAP1及び神経変性症原因分子との形態学的関係を免疫組織化学法で比較検討を行う計画であった。これについては、予定通り免疫組織化学染色による解析を行った。その結果、 STB/HAP1が発現する領域(特に視床下部、内側視索前野、内側扁桃体等)ではPCM1陽性構造は、神経細胞内で多くが細胞質に点状構造の局在性を示し、STB/HAP1を発現しない領域(線条体、視床等)では、散在性に細胞質に広がっていることを発見し、PCM1とSTB/HAP1との蛍光二重染色を行うとPCM1は神経細胞質内でSTB/HAP1に局在していることがわかった。またHttはいずれの領域でも細胞質に散在性に広がっていた。(4)ここまでを学会発表・論文作成を始める計画であったが、学会発表を行い、論文作成に着手し始めた。(5) 細胞周期の実験系については、形態学的な方法で予備実験を始めた。

今後の研究の推進方策

1. 脳内ではSTB/HAP1が発現する領域(特に視床下部、内側視索前野、内側扁桃体)としない領域(線条体、視床)の中心体関連分子とHAP1/STBおよび神経変性症原因分子huntingtin、AR、ataxin3等との形態学的関係のデータの解析を行う。
2. STB/HAP1を発現する細胞株と発現しない細胞株で中心体関連分子の形態学的データの収集とHAP1/STBおよび神経変性症原因分子huntingtin、AR、ataxin3等との形態学的関係のデータの収集と解析を行う。
3. STBに局在の見られた分子のGFP-PCM1cDNA等を細胞内導入して、これら外因性中心体関連分子とSTB/HAP1および神経変性症原因分子huntingtin、AR、ataxin3の関係をタイムラプスイメージングで解析する。
4. 細胞周期に伴う上記中心体関連分子の挙動に対してSTB/HAP1発現がもたらす局在変化のデータの収集と解析を行う。
5. また次年度に向けて種々の細胞死誘導系を準備し、HAP1や中心体関連分子のcDNAを導入できれば、一部データ収集を開始する。細胞死の誘導系は我々の過去の培養実験系で使用したstaurosporine、異常polyQ伸長アンドロゲン受容体のトランスフェクション、種々のストレス(Thapsigargin等による小胞体ストレス、虚血ストレス、低酸素ストレス、低糖ストレス、低アミノ酸ストレス、熱ショックストレス等)を基本とし、今回の実験系にどれが適するか前もってスクリーニングする。

次年度の研究費の使用計画

EZ-Capture MGと同等のウェスタンブロット解析用装置が共同利用の実験施設に設置されたため、これを購入する必要がなくなり、基金で予定していた経費の一部を補助金で使用したこと、次年度経費がかさむと想像される培養細胞を使った細胞周期やストレス付加実験、cDNAやsiRNAを使った実験等に使用できるよう、基金分の一部を次年度に繰り越すこととした事から、未使用額が生じた。
次年度予定されるin vivo、in vitroの細胞内ダイナミクス解析のための細胞組織化学的解析実験や培養細胞を使った細胞周期やストレス付加実験等でのゲノム抽出・シークエンス解析等に関連した試薬等の購入や、また数多くの中心対関連分子等に対する抗体やプラスミド、cDNAやsiRNAの作成等に関わる試薬購入等の経費に使用することを計画している。

  • 研究成果

    (12件)

すべて 2014 2013

すべて 学会発表 (12件) (うち招待講演 2件)

  • [学会発表] 細胞ストレス負荷による神経細胞質封入体stigmoid bodyの 形態変化~プロテアソーム活性の重要性~2014

    • 著者名/発表者名
      藤永 竜太郎 他
    • 学会等名
      第119回 日本解剖学会総会・全国学術集会
    • 発表場所
      下野市(自治医科大学)
    • 年月日
      20140327-20140329
  • [学会発表] 中心体関連蛋白質に注目した細胞質封入体stigmoid bodyの形態学的検討2014

    • 著者名/発表者名
      柳井 章江 他
    • 学会等名
      第119回 日本解剖学会総会・全国学術集会
    • 発表場所
      下野市(自治医科大学)
    • 年月日
      20140327-20140329
  • [学会発表] Neuroanatomical distribution of the STB/HAP1-immunoreactive cells in the spinal cord of the adult rat2014

    • 著者名/発表者名
      Md Nabiul Islam et al
    • 学会等名
      第119回 日本解剖学会総会・全国学術集会
    • 発表場所
      下野市(自治医科大学)
    • 年月日
      20140327-20140329
  • [学会発表] Distribution of the huntingtin-associated protein 1 (HAP1) in the spinal cord of the adult rat.2013

    • 著者名/発表者名
      M. N. Islam et al
    • 学会等名
      Neuroscience 2013
    • 発表場所
      San Diego(USA)
    • 年月日
      20131109-20131113
  • [学会発表] Species differences in the distribution of androgen receptor and sex differences in three newly identified species-specific clusters in the preoptic and anterior hypothalamic areas of the adult rats and mice.2013

    • 著者名/発表者名
      M. R. Jahan et al
    • 学会等名
      Neuroscience 2013
    • 発表場所
      San Diego(USA)
    • 年月日
      20131109-20131113
  • [学会発表] Neural expression of the Huntingtin-associated protein 1 in the hippocampus, with special reference to the relationship with of steroid receptors, GABA and progenitor cell markers2013

    • 著者名/発表者名
      Md. Nabiul Islam et al
    • 学会等名
      第40回 日本神経内分泌学会学術集会
    • 発表場所
      宮崎市(宮崎市民プラザ)
    • 年月日
      20131025-20131026
  • [学会発表] Differential expression of androgen receptor in the preoptic and anterior hypothalamic areas between the adult rats and mice2013

    • 著者名/発表者名
      Mir Rubayet Jahan et al
    • 学会等名
      第40回 日本神経内分泌学会学術集会
    • 発表場所
      宮崎市(宮崎市民プラザ)
    • 年月日
      20131025-20131026
  • [学会発表] Neuronal expression of the “sporadically lurking HAP-1 immunoreactive (SLH) cells” in the hippocampus, with special reference to the relationship with progenitor cell markers, GABA and steroid receptor.2013

    • 著者名/発表者名
      MD Islam et al
    • 学会等名
      第68回 日本解剖学会中四国支部学術集会
    • 発表場所
      米子市(鳥取大学)
    • 年月日
      20131019-20131020
  • [学会発表] 脳内ステロイド作用の修飾と神経変性~特に性ホルモンの芳香化と脳の性分化について~2013

    • 著者名/発表者名
      篠田 晃
    • 学会等名
      奈良先端バイオサイエンス研究科セミナー
    • 発表場所
      生駒市(奈良先端科学技術大学院大学)
    • 年月日
      20131004-20131004
    • 招待講演
  • [学会発表] 性ホルモンと脳の性; 性の二分律社会的観点からの性科学の重要性2013

    • 著者名/発表者名
      篠田 晃
    • 学会等名
      性差生物医学研究会セミナー
    • 発表場所
      宇部市(国際ホテル宇部)
    • 年月日
      20130626-20130626
    • 招待講演
  • [学会発表] Species and sex differences in androgen receptor expression in the preoptic areas and anterior hypothalamic areas of the adult rats and mice2013

    • 著者名/発表者名
      Mir R. Jahan et al
    • 学会等名
      Neuro2013
    • 発表場所
      京都市(国立京都国際会館)
    • 年月日
      20130620-20130623
  • [学会発表] Immunohistochemical distribution of the Huntingtin-associated protein 1( HAP1) in the spinal cord of adult rat2013

    • 著者名/発表者名
      MD Islam et al
    • 学会等名
      Neuro2013
    • 発表場所
      京都市(国立京都国際会館)
    • 年月日
      20130620-20130623

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公開日: 2015-05-28  

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