| 研究課題/領域番号 |
25293049
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| 研究機関 | 慶應義塾大学 |
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研究代表者 |
相馬 義郎 慶應義塾大学, 医学部, 准教授 (60268183)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | ABCトランスポ－タ－ / ATP加水分解 / NBDドメイン / 膜輸送 / 分子間相互作用 / 抗原抗体反応 / 原子間力顕微鏡 |
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| 研究実績の概要 |
異なる複数の分子間の相互作用は、生命システムを構成している最も重要な基本プロセスのひとつである。第2（平成26）年度は、CFTR１分子動態観察に加えて、分子間相互作用の高速AFM観察技術の確立をめざし、水チャネルAQP4への抗AQP4抗体の結合動態の直接観察を試みた。AQP4の二つのisoformであるM1-およびM23-AQP4のうち、M23-AQP4は生体膜中で集合して規則的なアレイ構造をとることが電子顕微鏡像により確認されている。発現・精製したM23-AQP4を、高速AFMステージ上に展開したリン脂質２重膜に組み込み、規則的なアレイ構造を取らせることに成功した。この規則アレイ中のM23-AQP4は、細胞内側をAFMステージ側に、細胞外側をAFM探査針側に向けていることが、高速AFMによる表面構造と結晶構造との比較、およびそれぞれAQP4細胞外および内ドメインを抗原とする抗体の結合の可否から確認できた。このM-23 AQP4アレイに抗AQP4モノクロナール抗体を投与して、高速AFMによる抗原－抗体反応の1分子レベルの直接観察に挑戦し、成功した。
CFTRについては、より大量のCFTR蛋白を発現・精製するために浮遊細胞培養用の振盪装置内蔵のCO2インキュベーター装置を、既存の機器を組み合わせて製作した。初年度に手法を確立したAFM ステージ上に展開した脂質２重膜中に再構成したCFTRに、PKA catalytic subunitを投与して高速AFM観察を行なったが、そのRドメインへの結合および、それに続発するRドメインの構造変化等を観察することはできなかった。
また、上記の実験に並行した共同研究で、CFTRの膵β細胞におけるインスリン分泌メカニズムでの役割の解明や、MDシミュレ―ションを用いたNBD二量体化における水のエントロピー・エンタルピーの寄与についての理論的研究を行なった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
初年度は、高速AFMの改良・最適化およびCFTRの高速AFM観察を並行して繰り返して行ない、CFTRの1分子動態観察を安定しておこなえる高速AFM装置を完成させると共にCFTR研究において特に注目されているRドメインが、CFTR分子の細胞内側底面部で揺らいでいるところを直接観察できた。このように揺らぐ構造物を特定・観察することは、従来行われてきた平均化構造を求める結晶構造解析や単粒子解析などでは得ることは不可能であり、RドメインのCFTR分子内での位置および動態について得られた初めての情報である。
第2年度は、CFTR１分子動態観察に加えて、分子間相互作用の高速AFM観察技術の確立をめざし、水チャネルAQP4への抗AQP4抗体の結合動態の直接観察を試みた。そして、高速AFMステージ上で、生体内と同様な規則的なアレイ構造を取っているM23-AQP4に対する抗AQP4抗体の結合動態の直接観察に成功した。生体内では、AQP4は神経系のアストロサイトに高密度に発現しており、AQP4に対する自己抗体によって視神経脊髄炎が引き起こされことが知られている。したがって、これは、ひとの自己免疫疾患における病態成立への最初の引き金となる自己抗体の自己抗原に対する結合の動態の1分子直接観察に世界で初めて成功したことを意味する。
CFTRについては、リン脂質２重膜に組み込んだ状態でPKA依存性リン酸化によって活性化される過程の直接観察に最大限の努力を払う傍ら、本研究の新規性・重要性に注目した当該分野の各研究者達からの招聘を受け、国内が行われた３つ国際学会シンポジウム、さらには、オーストラリア生理学会シンポジウムおよび米国ノースカロライナ大学チャペルヒル校Cystic Fibrosisセンターにて招聘講演を行った。
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| 今後の研究の推進方策 |
AQP4－抗AQP4抗体を材料とした、分子間相互作用の直接観察の研究をさらに進めていく予定である。高速AFMで得られた高い時空間分解能の、しかしながら限られた走査範囲と操作時間の断片的な動画データをつなぎ合わせ、正しいデータ解釈を行なうために、ELISAや蛍光ラベル抗体結合・解離の光学測定などの巨視的な抗原－抗体反応の測定を行ない、すべてのデータを包括的に説明できる動態モデルを作り、コンピュータシミュレーションを行なって定量的に評価・解釈を行なう予定でいる。
CFTRについては、まず、大量浮遊動物細胞培養系の最適化を行ないCFTR蛋白の高収量化を目指す。また、RドメインのPKA依存性リン酸化プロセスおよび、それに続発するRドメインの構造変化が容易に直接観察できるようにCFTRの精製過程を見直していく。それと並行して、Rドメインリン酸化プロセスをスキップする目的で、RドメインのPKAリン酸化コンセンサスサイトのセリンをアスパラギン酸に変異させたS-to-D変異CFTRを作成し、 そのチャネル活性のPKA非依存性を確認する。Rドメインにはメジャー４か所、マイナー４か所の計８か所のコンセンサスサイトが知られており、PKA非依存性チャネル活性および精製蛋白収量を指標にして、S-to-D変異を入れるサイトの探索を行なう。さらに、必要な場合にはRドメインを可能な限り切り詰めたpartial ΔR-CFTRやRドメインをintrinsically disordered proteinに置き換えたIDP ΔR-CFTRにもチャレンジする。
また、CFTRに加えて、相同性は高いがRドメインを持たないP-glycoprotein (ABCB1)も測定材料に加えることを考慮して、発現精製系の準備も進めておく予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
当該助成金はポスドク・実験補助を雇用するために使用する計画であった。しかし、残念ながら適当な人材が見つからず、それに加えて、連携研究者や研究協力者達の予想以上の当該研究への積極的な参加・協力により、当初の第２年度までの研究目標を上回る成果が得られることが見込まれたので、計画を変更して次年度に使用することにした。
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| 次年度使用額の使用計画 |
平成27年4月よりポスドク１名の雇用費用として使用する予定である。また、研究の進行状況を見て、適宜、実験補助の雇用を検討している。
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