| 研究課題/領域番号 |
25293055
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 研究機関 | 産業医科大学 |
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研究代表者 |
上田 陽一 産業医科大学, 医学部, 教授 (10232745)
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| 研究分担者 |
丸山 崇 産業医科大学, 医学部, 助教 (20533194)
橋本 弘史 産業医科大学, 医学部, 講師 (10454935)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | 浸透圧 / メカノセンサー / バゾプレッシン / 蛍光タンパク / 遺伝子改変動物 |
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| 研究概要 |
初年度（平成２５年度）は、以下の研究を行った。（１）バゾプレッシン-eGFPトランスジェニックラットを用いて等張性容量減少負荷として、ポリエチレングリコールの腹腔内投与を行った。その後、深麻酔下で灌流固定を行い、後固定後に視床下部視索上核および室傍核のeGFP蛍光を観察した。その結果、視索上核および室傍核大細胞群におけるeGFP蛍光の有意な増加が観察された。興味深いことに、室傍核小細胞群においてもeGFP蛍光の増加が観察された。今後、高張・低張浸透圧負荷における影響と比較したい。（２）c-fos-mRFP1トランスジェニックラットを用いて脱水および再飲水における脳内mRFP1発現の変化について検討した。さらに、c-fos-eGFPトランスジェニックラットを用いて急性浸透圧刺激として高張食塩水の腹腔内投与を行い、前脳および脳幹部におけるeGFP発現について検討した。その結果、脳内浸透圧感受性部位として知られる脳室周囲器官（脳弓下器官、終板器官など）、視索上核、室傍核および脳幹部（最後野、孤束核など）に著明なeGFP発現が観察された。（３）SACs（stretch-activated ion channelsの略）について検討するため、ニューロンに機械的刺激を行う装置をセットアップした。バゾプレッシン-eGFPトランスジェニックラットおよびオキシトシン-mRFP1トランスジェニックラットの視床下部視索上核から細胞を単離し、eGFP蛍光もしくはmRFP1蛍光を指標にして同定したニューロンからパッチクランプ法により電流を記録しながら機械的刺激を行った。その結果、機械的刺激が誘発する内向き電流を再現性よく記録することができた。今後、さらに電気生理学的性質を検討したい。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
（１）バゾプレッシン-eGFPトランスジェニックラットを用いて等張性容量減少における視床下部視索上核および室傍核におけるeGFP蛍光の変化を捉えることができた。今後、高張・低張浸透圧負荷における影響とを比較することにより、バゾプレッシンニューロンでの浸透圧・容量変化に特異的な分子を同定したい。（２）c-fos-mRFP1およびc-fos-eGFPトランスジェニックラットを用いて、mRFP1およびeGFP蛍光を指標に脳内の浸透圧感受性部位を同定することができた。今後、それらのニューロンから浸透圧変化に特異的な分子を同定したい。（３）単一細胞に機械的刺激を行うための装置をセットアップした。バゾプレッシン-eGFPおよびオキシトシン-mRFP1トランスジェニックラットの視床下部視索上核から単離したeGFP蛍光およびmRFP1蛍光陽性ニューロンに機械刺激を行い、パッチクランプ法を用いて機械刺激が誘発する内向き電流を記録することができた。その生理学的性質の検討および責任分子についての同定は未だである。
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| 今後の研究の推進方策 |
（１）バゾプレッシン-eGFPトランスジェニックラットを用いて等張性容量減少、高張・低張浸透圧負荷におけるeGFP蛍光の変化を指標にそれぞれの刺激特異的な分子群を同定することを今後の方策とする。（２）c-fos-mRFP1およびc-fos-eGFPトランスジェニックラットを用いて同定した脳内の浸透圧感受性部位からmRFP1蛍光およびeGFP蛍光を指標に浸透圧変化に特異的な分子を同定することを今後の方策とする。（３）セットアップできた機械的刺激を行うための装置を用いて、バゾプレッシン-eGFPおよびオキシトシン-mRFP1トランスジェニックラットの視床下部視索上核および室傍核から単離したeGFP蛍光およびmRFP1蛍光陽性ニューロンに機械刺激を行い、パッチクランプ法によって記録することができる電流の電気生理学的性質の検討を行う。さらに、細胞質を吸引し、RT-PCR法を用いて責任分子の同定を試みる。
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