神経変性疾患発症に関与するＰＫＣリン酸化基質タンパク質の同定と創薬への応用

2013 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 25293060
• 研究種目: 基盤研究(B)
• 研究機関: 神戸大学
• 研究代表者: 齋藤 尚亮 神戸大学, バイオシグナル研究センター, 教授 (60178499)
• 研究分担者: 上山 健彦 神戸大学, バイオシグナル研究センター, 准教授 (80346254) ; 足立 直子 神戸大学, バイオシグナル研究センター, 助教 (70604510)
• 研究期間 (年度): 2013-04-01 – 2016-03-31
• キーワード: プロテインキナーゼC / パーキンソン病 / モデルマウス / 質量分析 / ドーパミン

研究概要

プロテインキナーゼCgamma(PKCgamma) のナンセンス変異を持つAS/AGUラットはパーキンソン症状を呈する。我々は、AS/AGUラットがPKCgammaノックアウト(KO)であること、PKCgammaKOマウスが線条体ドパミン(DA)放出や黒質DA神経細胞変性などのパーキンソン症状を呈することを示したことから、我々はPKCgammaKOマウスがパーキンソン病のモデルになることを提唱した。しかしながら、PKCgammaKOマウスは、黒質線条体系以外でも多くの神経情報伝達機構の異常をもたらしているため、PKCgammaKOマウスをパーキンソン病のモデルとして、薬物スクリーニングに使用することには問題があった。そこで、黒質線条体のPKCgammaの基質がリン酸化されなくなることがパーキンソン症状の原因であるという仮説を考え、PKCgammaKOと野生型(WT)のマウス線条体を用い、PKCgammaの基質の同定を目的として、リン酸化プロテオーム解析を行った。
まず、Ion intensityを用いた半定量的解析により、PKCリン酸化モチーフを持つ９個のタンパクを同定した。本年度は、このうちbetaPIXに着目し、集中的にその解析を行った。 betaPIXは、Ser583はin vitro, in vivoで、Ser340はin vivoでPKCgammaによりリン酸化された。また、PC12細胞でのDA遊離測定では、betaPIXノックダウンによるDA遊離低下をbetaPIX WTで回復できたのに対して、betaPIX Ser340Ala, Ser583Ala変異体では、DA遊離は回復しなかった。
以上のことより、線条体におけるPKCgammaの基質候補として9個のタンパクを同定し、その中のbetaPIXについてPKCgammaによりSer583, Ser340がリン酸化を受け、DA遊離に関与することを示した。これらの結果は、betaPIX が黒質線条体におけるPKCgammaの基質であり、DA遊離に関与することを示唆している。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

当初、着目する分子として、betaPIX、 CSPalpha、MADDの3分子を挙げたが、そのうち、betaPIXについては解析を終了し、その結果をJ. Neurosci誌に投稿した結果、ほぼ受理に近い返事をもらっている。CSPalpha、MADDについてはもちろん、他のリン酸化基質分子についても、すでにドパミン遊離に与える影響についてスクリーニングを行い、興味深い結果を得ている。

今後の研究の推進方策

１） 他の候補となるPKCgamma基質タンパクについても、本年度と同様の解析を行い、PKCgammaによるリン酸化部位の同定とドパミン遊離に対するリン酸化の作用を検討する。
２） betaPIX変異体のノックインマウスを作製する。つまり、本年度明らかになったbetaPIXのPKCgammaによりリン酸化部位に変異を導入したノックインマウスを作製し、PKCgammaによるリン酸化の消失により、パーキンソン様症状を示すか否かを検討する。これにより、全く新しい、パーキンソン病モデルマウスの作製を試みる。

次年度の研究費の使用計画

当初は3つの候補分子に関する解析を同時に行うことを予定していたが、betaPIXの解析に予想以上に時間を要したこと、また、1分子ずつ順番にやる方が論文作成の上で無駄がないと考えたため、betaPIXに集中して実験を行った。それにより、必要な物品費が予想より少な勝ったため、次年度使用額が生じた。
次年度は同じ要領ですべての候補タンパク質についての解析を行うとともに、ノックインマウスの作製にも取り掛かるため、より多くの物品費が必要となる。本年度使用しなかった物品費を次年度に使用する予定である。

研究成果

• [雑誌論文] Diacylglycerol kinase gamma regulates antigen-induced mast cell degranulation by mediating Ca2+ influxes (2014)
  • 著者名/発表者名: Sakuma, M., Shirai, Y., Ueyama, T., and Saito, N.
  • 雑誌名: Biochem. Biophys. Res. Commun, 巻: 445 ページ: 340-345
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2014.01.197
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Deregulation of the actin cytoskeleton and macropinocytosis in response to phorbol ester by the mutant protein kinase C gamma that causes spinocerebellar ataxia type 14 (2014)
  • 著者名/発表者名: Yamamoto, K., Seki, T., Yamamoto, H., Adachi, N., Tanaka, S., Hide, I., Saito, N. and Sakai, N.
  • 雑誌名: Frontiers in Physiology 巻: 5 ページ: 1-10
  • DOI: 10.3389/fphys.2014.00126
  • 査読あり
• [雑誌論文] Diacylglycerol kinase as a possible therapeutic target for neuronal diseases. (2014)
  • 著者名/発表者名: Shirai, Y and Saito, N
  • 雑誌名: Journal of Biomedical Science 巻: 21 ページ: 28-36
  • 査読あり
• [雑誌論文] Both the C1 domain and a basic amino acid cluster at C-terminus are important for neurite and branch induction ability of DGKbeta (2014)
  • 著者名/発表者名: Takuya Kano, Takeshi Kouzuki, Satoru Mizuno, Shuji Ueda, Minoru Yamanoue, Fumio Sakane, Naoaki Saito and Yasuhito Shirai
  • 雑誌名: Takuya Kano, Takeshi Kouzuki, Satoru Mizuno, Shuji Ueda, Minoru Yamanoue, Fumio Sakane, Naoaki Saito and Yasuhito Shirai 巻: 印刷中 ページ: 印刷中
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2014.03.113
• [雑誌論文] Maintenance of stereocilia and apical junctional complexes by Cdc42 in cochlear hair cells, (2014)
  • 著者名/発表者名: Ueyama, T., Sakaguchi, H., Nakamura, T., Goto, A., Morioka, S., Shimizu, A., Nakao, K., Hishikawa, Y., Ninoyu, Y., Kassai, H., Suetsug, J., Koji, T., Fritzsch, B., Yonemura, S., Hisa, Y., Matsuda, M., Aiba, A., and Saito, N.
  • 雑誌名: J. Cell Science 巻: 印刷中 ページ: 印刷中
  • 査読あり
• [雑誌論文] Negative charges in the flexible N-terminal domain of Rho GDP-dissociation inhibitors (RhoGDIs) regulate the targeting of the RhoGDI-Rac1 complex to membranes. (2014)
  • 著者名/発表者名: Ueyama T, Son J, Kobayashi T, Hamada T, Nakamura T, Sakaguchi H, Shirafuji T, Saito N.
  • 雑誌名: J Immunol. 巻: 191 ページ: 2560-2569
  • DOI: 10.4049/jimmunol.1300209
  • 査読あり
• [雑誌論文] Mutant γPKC that causes spinocerebellar ataxia type 14 upregulates Hsp70, which protects cells from the mutant's cytotoxicity. (2013)
  • 著者名/発表者名: Ogawa, K., Seki, T., Onji, T., Adachi, N., Tanaka, S., Hide, I., Saito, N. and Sakai, N.
  • 雑誌名: Biochem. Biophys. Res. Commun 巻: 440 ページ: 25-30
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2013.09.013.
  • 査読あり
• [雑誌論文] PKC-ε pseudosubstrate and catalytic activity are necessary for membrane delivery during IgG-mediated phagocytosis (2013)
  • 著者名/発表者名: Wood, TR., Chow, RY., Hanes, CM., Zhang, X., Kashiwagi, K., Shirai, Y., Trebak, M., Loegering, DJ., Saito, N., and Lennartz, MR.
  • 雑誌名: J Leukoc Biol 巻: 94 ページ: 109-122
  • DOI: 10.1189/jlb.1212634
  • 査読あり
• [雑誌論文] Increased seizure susceptibility in a mouse with diacylglycerol kinase β 2 deficiency (2013)
  • 著者名/発表者名: Ishisaka, M., Tsuruma, K., Shimazawa, M., Shirai, Y., Saito, N., and Hara, H.
  • 雑誌名: Neuroscience & Medicine 巻: 4 ページ: 117-122
  • 査読あり
• [雑誌論文] Protein kinase Cη is targeted to lipid droplets. (2013)
  • 著者名/発表者名: Suzuki, M., Iio, Y., Saito, N., and Fujimoto, T.
  • 雑誌名: Histchem Cell Biol. 巻: 139 ページ: 505-511
  • DOI: 10.1007/s00418-013-1083-z
  • 査読あり
• [雑誌論文] Both C1B domain and pseudosubstrate region are necessary for saturated fatty acidmembrane; distinct role of intramolecular domains for different translocation. (2013)
  • 著者名/発表者名: Nishimoto, T., Kashiwagi, K., Saito, N., and Shirai, Y
  • 雑誌名: Biochem Biophys Res Commun 巻: 432 ページ: 384-388
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2013.01.048
  • 査読あり
• [学会発表] Protein kinase C and its involvement in neurodegenerative disease (2014)
  • 著者名/発表者名: Naoaki Saito
  • 学会等名: Symposium on Membrane Biology
  • 発表場所: Seattle WA, USA
  • 年月日: 20140327-20140327
  • 招待講演
• [学会発表] A protein kinase Cgamma knockout mice as a Parkinsonian model: Involvement of Pak -Interacting Exchange Factorbeta (2014)
  • 著者名/発表者名: 齋藤尚亮
  • 学会等名: 第87回日本薬理学会年会
  • 発表場所: 仙台
  • 年月日: 20140319-20140322
• [学会発表] Cde-42 is required for maintenance of stereocilia and apical junctional complexes in cochlear hair cells (2014)
  • 著者名/発表者名: Ueyama, T. and Saito, N.
  • 学会等名: Joint Workshop between University Catholic Louvain and Kobe University
  • 発表場所: Brussels, Belgium
  • 年月日: 20140310-20140310
• [学会発表] 黒質線条体系におけるPKCγの基質の解析：β2PIXリン酸化のドパミン遊離への 役割 (2013)
  • 著者名/発表者名: 白藤 俊彦、上山 健彦、吉野 健一、足立 直子、高橋 英之、香田 健、 平松 直樹、吾郷 由希夫、松田 敏夫、酒井 規雄、齋藤 尚亮
  • 学会等名: 第124回日本薬理学会近畿部会
  • 発表場所: 京都
  • 年月日: 20131101-20131101
• [学会発表] Both C1 domain and basic amino acid cluster at C-terminus are important for branching and neurite induction of DGK (2013)
  • 著者名/発表者名: Shirai,Y., Takuya,K., Kouzuki,T., Ueda,S., Yamanoue,M., Sakane,F. and Saito,N.
  • 学会等名: Neuro 2013
  • 発表場所: 京都
  • 年月日: 20130620-20130623