| 研究課題/領域番号 |
25293070
|
|---|
| 研究機関 | 大阪大学 |
|---|
研究代表者 |
大森 義裕 大阪大学, たんぱく質研究所, 准教授 (90469651)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
|
| キーワード | 網膜 / シナプス / 視細胞 / 双極細胞 / リボンシナプス / 遺伝子欠損マウス / 膜貫通蛋白質 / electroretinogram (ERG) |
|---|
| 研究実績の概要 |
これまでに、視細胞の運命決定を制御する転写因子であるOtx2のconditional knockout (CKO)マウスの網膜を用いたマイクロアレイ解析から得られた網膜における発現情報や、網膜におけるin situハイブリダイゼーションやノザンブロッティングによる組織パネルの解析から候補遺伝子を抽出し、複数系統の遺伝子欠損マウスの確立を行ってきた。昨年度は、そのうち候補遺伝子のホモ遺伝子欠損マウスが完成した。このマウスを用いて、これまでに確立した高感度なLED一体型電極を用いた網膜電図解析（electroretinogram, ERG）を行ったところ、双極細胞由来の波形であるERGのb波の振幅および潜時に明らかな異常を示すことを見出した。この候補蛋白質は、シグナルシーケンスとPDZ結合モチーフを持つ膜1回蛋白質である。次に、この候補蛋白質とGSTの融合蛋白質を大腸菌にて発現させ、候補蛋白質に対する抗体を作製した。培養細胞において作製した抗体の特異性を確認したところ、特異性が高く他の相同遺伝子にはオーバーラップしないことが明らかとなった。網膜組織を用いて蛍光免疫染色を行ったところ候補蛋白質は双極細胞と視細胞が接続する外網状層のシナプス（リボンシナプス）に局在することがわかった。遺伝子欠損マウスでこのシグナルは消失したことから、候補蛋白質はシナプスに局在する蛋白質であることがわかった。これまでの結果から、候補蛋白質は視細胞と双極細胞のシナプスの形成に重要な役割をもつことが明らかとなった。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
昨年度は、作製した候補遺伝子のホモ欠損マウスの表現型解析を進めることができ、ERGに明らかな異常を見出すことに成功した。また、良質な抗体の作製に成功し、リボンシナプスにおける局在の解析を行うことができた。これらのことから、本研究は順調に進展していると考えている。
|
| 今後の研究の推進方策 |
本年度は、ホモ遺伝子欠損マウスの網膜組織における視細胞―双極細胞間のシナプスマーカーの局在を解析することで候補蛋白質の機能を解析する。さらに、シナプスにおける詳細な候補蛋白質の局在を調べるためにSTEDやSIMによる超解像顕微鏡解析を行う準備を進めている。ホモ遺伝子欠損マウスの視機性眼球反応（OKR）を解析することで、候補蛋白質の視覚における機能を明らかにする。一方、生化学的な解析により、候補蛋白質と相互作用する分子の同定を進める予定である。これまでに知られている網膜のシナプスに局在する蛋白質との相互作用を免疫沈降法やプルダウンアッセイにより確認する。また、候補蛋白質に対する抗体を用いて組織から免疫沈降を行い、プロテオミクス解析等により相互作用する因子を探索することを試みる予定である。加えて、これまでに作製したその他の遺伝子欠損マウスの解析も継続する予定である。本研究で得られた結果を、論文として英文科学雑誌に投稿し、専門学会において学会発表も行う予定である。これらの実験を進めることで、これまでに明らかとなっていなかった視細胞-双極細胞間の接続形成と情報伝達の分子メカニズムを明らかにしたい。
|
| 備考 |
研究内容に関するページ
|
