| 研究課題/領域番号 |
25293074
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| 研究機関 | 東北大学 |
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研究代表者 |
神崎 展 東北大学, 医工学研究科, 准教授 (10272262)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | インスリン抵抗性 / 細胞内小胞輸送系 / 生活習慣病 / GLUT4 |
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| 研究実績の概要 |
昨年度までにGLUT4とSortilinを発現した細胞に対して，外来性にVps10pリガンド類[グラニュリン前駆体や脳由来神経栄養因子(BDNF)前駆体]を添加することにより細胞内GLUT4含量が変化することを観察し，「Vps10p受容体(Sortilin):分泌性リガンド類：複数回膜貫通型蛋白質（GLUT4）」からなるTripartite Complex形成がこれらの細胞内含量（と機能）の制御において生理的に重要であることを確認している．本年度は，このTripartite Complex形成の重要性をさらに強固に確認する目的で，Vps10p受容体のC末端の細胞質領域の機能を人為的に修飾することによってGLUT4の細胞内含量と細胞内局在変化（細胞膜へのトランスロケーション量）がどのように影響を受けるのかについて，生化学的および細胞生物学的な解析をおこなった．実験的には，SortilinのC末端領域配列を含み，さらに脂肪酸修飾を施した合成ペプチドを作製して，上記培養細胞に添加して，内在性の細胞内Sortilin含量, GLUT4含量,およびグラニュリン分泌量の変化を計測してTripartite Complexの機能的連関性を総合的に判定した．さらに，上記を目的とした各種変異体型Sortilinの発現実験も併行しておこなった．その結果，SortilinのC末端ソーティングモチーフ機能を人為的に修飾することによっても，GLUT4含量とトランスロケーション量が有意に変動することを確認した．各種変異体および変異合成ペプチドによる実験からTripartite Complex形成に関わる責任領域をある程度同定することに成功した．
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
各リガンドの結合領域となるVps10pドメインの機能を，外来性リガンドの大量投与などにより人為変化させることでもう一つの会合パートナーとなるGLUT4との複合体形成効率が変化して，GLUT4の細胞内ソーティング様式，さらにはインスリン応答性GLUT4トランスロケーション効率が有意に影響を受けることを見いだすことができた．さらに，細胞内では小胞腔内に位置するVps10pドメインの重要性に加えて，そのC末端領域（細胞質側ドメイン）にも，GLUT4との会合に関与するソーティング・会合モチーフが存在する可能性を脂質修飾型Sortilin合成ペプチドを用いた解析より明らかにすることができた．また，小胞腔内でのTripartite Complex形成には，細胞質側での膜蛋白同士の会合状態も重要であることを示す重要な発見であると考えている．
また，エンドソーム内にて一時的に形成すると考えられる過渡的分子複合体の分子輸送動態をリアルタイムイメージング解析できる蛍光顕微鏡システムを構築することができた．さらに，細胞質側において複合体形成の制御に関与する機能分子（モーター蛋白・アダプター蛋白）を量子ドットで特異標識する手法も新たに確立することができた．これらを組み合わせた独自の可視化ナノ計測解析手法を駆使することによって本研究課題のさらなる展開が期待できると考えている．
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| 今後の研究の推進方策 |
比較的高濃度の遊離脂肪酸誘導性のインスリン抵抗性病態において， Vps10p受容体（Sortilin）とGLUT4のmRNA発現低下と引き続く各々蛋白質含量が有意に減少することをこれまでに明らかにしている．H27年度は，インスリン抵抗性病態を呈したこの遊離脂肪酸誘導性のインスリン抵抗性病態において，「ソーティング障害とその病態分子基盤」におけるTripartite Complex複合体の重要性という観点から，この病態モデル細胞での分泌性リガンド類（グラニュリン,BDNF）の分泌量と分泌様式について詳細に解析する．特に，①既存のインスリン抵抗性改善薬(PPARアゴニスト)の効能検証，②各種リガンド分子（群）や，Sortilin/C末端ソーティングモチーフ合成ペプチドを外来性添加実験を遂行することにより，ソーティング障害をある程度人為操作（是正）することを試み，これらの人為操作によってインスリン応答性GLUT4トランスロケーションやVps10p受容体量の回復，すなわち治療的な効果を誘導できるかどうかについて検討する．
これらの実験を遂行することにより，「solubleリガンドvs. Vps10p受容体」という高親和性結合調節に加えて、複数膜貫通型蛋白(GLUT4)も参画した三つどもえ”Tripartite Complex”のAssembly/Disassembly調節が細胞内ソーティングを規定し、solubleリガンド分泌量と機能蛋白局在化が統合的に制御されるという生体ナノシステム制御の重要性とその病態における破綻を定量的に示すとともに，このナノシステム障害の是正を試みることにより、その治療標的としての可能性を検証する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
予定していた学会に出席しなかったことため，差額が生じた．
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| 次年度使用額の使用計画 |
H26年度に生じた差額分は実験試薬の購入費用として適正に使用する予定である．
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