歌舞伎症候群解析から広げる全ゲノム対象エピジェネティック解析法の開発

2013 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 25293084
• 研究種目: 基盤研究(B)
• 研究機関: 長崎大学
• 研究代表者: 吉浦 孝一郎 長崎大学, 原爆後障害医療研究所, 教授 (00304931)
• 研究分担者: 太田 亨 北海道医療大学, 個体差健康科学研究所, 教授 (10223835)
• 研究期間 (年度): 2013-04-01 – 2016-03-31
• キーワード: エピジェネティック変化 / 歌舞伎症候群 / ゲノム編集

研究概要

歌舞伎症候群の病態解明のため，細胞内のゲノム全体を対象にしたヒストンのメチル化状態の把握をはかり，プロファイリングを明らかにしておく必要がある。歌舞伎症候群の原因遺伝子は判明したが，細胞機能のどこかの一点だけを修正すれば治療可能な疾患ではないことが解ってきたといってよい。治療への道筋を考えた場合に，どの症状が治療可能なのか・どういった治療薬が必要なのかを考慮する際に，ヒストンのメチル化・アセチル化プロファイリングが必須であると考え，それらを明らかにする事を目標とした。
第一に，今後のエピジェネティックプロファイリング作成のために患者の生細胞が必要である。本年度，患者は，新規および既知の患者であるが，再同意取得とMLL2およびKDM6A遺伝子変異解析を行いながら，最も簡便な末梢血からの有核白血球の収集をはかった。末梢白血球 10 例分を収集し保存した。
第二に，ゲノム編集を行い基準線維芽細胞から変異を有する細胞の構築を目指し，CRSPER/Cas9システム活用のための予備的実験を行った。受精卵にRNAを注入した場合には，非常に効率良くゲノム編集が可能であるが，通常の発現ベクターをつかってのトランスフェクッション実験では，ゲノム編集が出来ない。現在，エピジェネティック疾患関連遺伝子変異細胞ライブラリー構築のために，初代培養線維芽細胞においてゲノム編集が可能となるように，ベクターの変更，改変等を行っている。
第三に，MLL2およびKDM6A遺伝子変異陰性例12名の exome 解析を行った。しかし，患者に共通に認められる変異遺伝子は認められていない。今後，親子トリオにて新生突然変異探索を行っていく。

現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

歌舞伎症候群患者細胞収集および exome 解析は，順調に進んでいる。
一方，線維芽細胞でのゲノム編集に関して技術的に解決すべき問題が起こり多少遅れている。CRISPR/Cas9発現ベクターを導入しても，ゲノムDNA切断が起こっていないようで，発現ベクターのプロモーターを交換している。マウス受精卵では本システムは，働くことから十分に改良可能である。

今後の研究の推進方策

歌舞伎症候群患者の生細胞（末梢血有核細胞）保存と既知遺伝子（MLL2遺伝子，KDM6A遺伝子）変異陰性例の exome 解析は，順調に進めている。
平成26年度からは，患者細胞を使った Chromatin Immunoprecipitation - Sequence 解析をスタートさせ，歌舞伎症候群患者末梢血でのエピジェネティック異常の検出を進める。
現在，CRSPER/Cas9によるゲノム編集を線維芽細胞で利用できるようにすることが，今後のエピジェネティック関連遺伝子病の解析に重要であるので，ベクターの改変等によって当初の目的である「システマティックなゲノム編集によるエピジェネティック関連遺伝子変異細胞株ライブラリーの構築」をはかる。遺伝子群のepigenetics制御に対する役割をin vitro で解析するために正常線維芽細胞に遺伝子変異を導入する。次年度以降の全ゲノム対象ヒストンメチル化・アセチル化解析のための材料とする。

次年度の研究費の使用計画

初年度は，CRISPR/Cas9 システムがきちんとゲノム編集に使える様に最適化することに注力し，遺伝子ノックアウトした変異細胞ライブラリーの作成には着手せず，またその次のステップであるクロマチン免疫沈降-塩基配列決定まで進むことが出来なかった。
そのため，遺伝子ノックアウトした変異細胞ライブラリーの作成，次世代シーケンサーによる塩基配列決定作業が後回しとなり差額が生じた。
初年度にCRISPR/Cas9 システムの改良点を把握して改良を進めているので，平成26年度に変異細胞ライブラリーの作成，次世代型シーケンサーによる塩基配列決定作業に使用する。

研究成果

• [雑誌論文] MLL2 and KDM6A mutations in patients with Kabuki syndrome. (2013)
  • 著者名/発表者名: Miyake N, Koshimizu E, Tsurusaki Y, Saitsu H, Yoshiura K, Matsumoto N, Niikawa N, et al.
  • 雑誌名: American Journal of Medical Genetics, part A. 巻: 245(5) ページ: 363-368
  • DOI: 10.1002/ajmg.a.36072
  • 査読あり
• [雑誌論文] Malfunction of the ERCC1/XPF endonuclease results in diverse clinical manifestations and causes three nucleotide excision-repair-deficient disorders, Cockayne Syndrome, xeroderma pigmentosum and Fanconi Anemia. (2013)
  • 著者名/発表者名: Kashiyama K, Nakazawa Y, Pilz D, Guo C, Shimada M, Sasaki K, Fawcett H, Wing J, Lewin S, Carr L, Yoshiura K, Utani A, Hirano A, Yamashita S, Greenblatt D, Nardo T, Stefanini M, McGibbon D, Sarkany R, Fassihi H, Takahashi Y, Nagayama Y, Mitsutake N, Lehmann AR, and Ogi T.
  • 雑誌名: American Journal of Human Genetics 巻: 92(5) ページ: 807-819
  • DOI: 10.1016/j.ajhg.2013.04.007
  • 査読あり
• [雑誌論文] Copy number variation of the antimicrobial-gene, defensin beta 4, is associated with susceptibility to cervical cancer. (2013)
  • 著者名/発表者名: Abe S, Miura K, Kinoshita A, Mishima H, Miura S, Yamasaki K, Hasegawa Y, Higashijima A, Jo O, Sasa K, Yoshida A, Yoshiura K, Masuzaki H.
  • 雑誌名: Journal of Human Genetics 巻: 58(5) ページ: 250-253
  • DOI: 10.1038/jhg.2013.7
  • 査読あり
• [学会発表] Ion AmpliSeqTM Custom Panel を用いたKabuki症候群の変異解析． (2013)
  • 著者名/発表者名: 渡辺 聡，三嶋博之，朝重耕一，木下晃，吉浦孝一郎
  • 学会等名: 第58回日本人類遺伝学会
  • 発表場所: 江陽グランドホテル，宮城
  • 年月日: 20131120-20131123
• [学会発表] 地域蓄積・収集した稀少難病の遺伝子原因究明と遺伝性疾患診断システムの構築． (2013)
  • 著者名/発表者名: 吉浦孝一郎
  • 学会等名: 公開シンポジウム－次世代遺伝子解析装置を用いた難病の原因究明，治療法開発研究プロジェクトの成果－
  • 発表場所: 都市センターホテル, 東京
  • 年月日: 20130713-20130713