歌舞伎症候群解析から広げる全ゲノム対象エピジェネティック解析法の開発

2014 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 25293084
• 研究機関: 長崎大学
• 研究代表者: 吉浦 孝一郎 長崎大学, 原爆後障害医療研究所, 教授 (00304931)
• 研究分担者: 太田 亨 北海道医療大学, 個体差健康科学研究所, 教授 (10223835)
• 研究期間 (年度): 2013-04-01 – 2016-03-31
• キーワード: エピジェネティクス / ヒストンメチル化 / ゲノム編集 / 変異

研究実績の概要

歌舞伎症候群の病態解明のため，細胞内ゲノム全体を対照にしたヒストンのメチル化状態の把握をはかり，プロファイリングを明らかにしておく必要がある。歌舞伎症候群の２つの原因遺伝子は，KMT2DとKDM6Aと判明した。前者はヒストンH3-K9のトリメチル化酵素であり，後者はヒストンH3-K27の脱メチル化酵素であると考えられている。つまり，ヒストンのメチル化修飾異常が歌舞伎症候群の本体である。本研究では，KMT2DとKDM6Aの修飾ターゲットを探索するとともに，培養細胞での実験系構築を図る。
本年度も昨年度に引き続き，歌舞伎症候群患者について，既試料の再同意取得と新規試料の末梢有核白血球を取得保存した。
第二に，ゲノム編集を行い基準線維芽細胞から変異を有する細胞の構築を目指し，CRSPER/Cas9システム活用のための実験を行った。通常の発現ベクターをつかってのトランスフェクッション実験では，ゲノム編集が出来ない。CRSPER/Cas9 のベクターに薬剤耐性遺伝子を組み込み，薬剤スクリーニングを行えば線維芽細胞をクローンとして取得出来る。つまり，ゲノム改変は可能であるが，まだ効率に問題があり，効率ベクターの変更，改変等を行っている。
昨年度，KMT2DおよびKDM6A遺伝子変異陰性例12名については exome 解析にても原因変異は見つからなかった。本年度は，KMT2D (MLL2) の変異解析はイントロンも含めて実施するためにキャプチャー濃縮とパーソナルタイプ次世代シーケンサーを使った解析を実施した。しかし，変異陰性例では，現在までの所イントロンにも変異は無い。

現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

CRISPR/Cas9 系の実験で，正常線維芽細胞での編集効率が上がらないため，in vitro 実験系の構築が進んでいない。

今後の研究の推進方策

最終年度に向けて，本研究の柱となっている歌舞伎症候群原因新規遺伝子同定と患者末梢有核白血球を使って，ヒストンメチル化抗体による免疫沈降－＞塩基配列解析（ChIP-Seq解析）を重点的に進める。CRISPR/Cas9 系の実験で，正常線維芽細胞での編集効率上昇を目指した基礎実験は引き続き実施するが，in vitro 実験からのKMT2Dの制御ターゲット遺伝子の同定は，年度内には結果は得られない可能性がある。

次年度使用額が生じた理由

計画が送れているために，CRISPR/Cas9 システム 立ち上げと免疫沈降-塩基配列決定（ChIP-Seq）の実験が主であり，細胞培養，少量塩基配列決定に費用が充てられた。構成的な変異細胞群のライブラリー作成と次世代シーケンサーの本格的な稼働にまで至らずに，差額が生じている。

次年度使用額の使用計画

構成的な変異細胞群のライブラリー作成と次世代シーケンサーの本格的な稼働を行う。

研究成果

• [雑誌論文] Genome-wide association study of HPV-associated cervical cancer in Japanese women. (2014)
  • 著者名/発表者名: Miura K, Mishima H, Kinoshita A, Hayashida C, Abe S, Tokunaga K, Masuzaki H, Yoshiura KI.
  • 雑誌名: Journal of Medical Virology 巻: 86 (7) ページ: 1153-1158
  • DOI: doi: 10.1002/jmv.23943.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Heterozygous mutations in cyclic AMP phosphodiesterase-4D (PDE4D) and protein kinase A (PKA) provide new insights into the molecular pathology of acrodysostosis. (2014)
  • 著者名/発表者名: Kaname T, Ki CS, Niikawa N, Baillie GS, Day JP, Yamamura KI, Ohta T, Nishimura G, Mastuura N, Kim OH, Sohn YB, Kim HW, Cho SY, Ko AR, Lee JY, Kim HW, Ryu SH, Rhee H, Yang KS, Joo K, Lee J, Kim CH, Cho KH, Kim D, Yanagi K, Naritomi K, Yoshiura KI, Kondoh T, Nii E, Tonoki H, Houslay MD, Jin DK.
  • 雑誌名: Cellular Signaling 巻: 26 (11) ページ: 446-2459
  • DOI: doi: 10.1016/j.cellsig.2014.07.025.
  • 査読あり
• [雑誌論文] De novo SOX11 mutations cause Coffin-Siris syndrome. (2014)
  • 著者名/発表者名: Tsurusaki Y, Koshimizu E, Ohashi H, Phadke S, Kou I, Shiina M, Suzuki T, Okamoto N, Imamura S, Yamashita M, Watanabe S, Yoshiura K, Kodera H, Miyatake S, Nakashima M, Saitsu H, Ogata K, Ikegawa S, Miyake N, Matsumoto N.
  • 雑誌名: Nature Communications 巻: 5 ページ: 4011
  • DOI: doi: 10.1038/ncomms5011.
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Clinical applications of analysis of plasma circulating complete hydatidiform mole pregnancy-associated miRNAs in gestational trophoblastic neoplasia: A preliminary investigation. (2014)
  • 著者名/発表者名: Miura K, Hasegawa Y, Abe S, Higashijima A, Miura S, Mishima H, Kinoshita A, Kaneuchi M, Yoshiura K, Masuzaki H.
  • 雑誌名: Placenta 巻: 35 (9) ページ: 787-789
  • DOI: doi: 10.1016/j.placenta.2014.06.004.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Circulating levels of maternal plasma cell-free pregnancy-associated placenta-specific microRNAs are associated with placental weight. (2014)
  • 著者名/発表者名: Miura K, Morisaki S, Abe S, Higashijima A, Hasegawa Y, Miura S, Tateishi S, Mishima H, Yoshiura K, Masuzaki H.
  • 雑誌名: Placenta 巻: 35 (10) ページ: 848-851
  • DOI: doi: 10.1016/j.placenta.2014.06.002.
  • 査読あり
• [雑誌論文] ABCC11/MRP8 Expression in the Gastrointestinal Tract and a Novel Role for Pepsinogen Secretion. (2014)
  • 著者名/発表者名: Matsumoto H, Tsuchiya T, Yoshiura K, Hayashi T, Hidaka S, Nanashima A, Nagayasu T.
  • 雑誌名: Acta Histochemica et Cytochemica 巻: 47 (3) ページ: 85-89
  • DOI: doi: 10.1267/ahc.13040.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Predominantly placenta-expressed mRNAs in maternal plasma as predictive markers for twin-twin transfusion syndrome. (2014)
  • 著者名/発表者名: Miura K, Higashijima A, Miura S, Mishima H, Yamasaki K, Abe S, Hasegawa Y, Kaneuchi M, Yoshida A, Kinoshita A, Yoshiura K, Masuzaki H.
  • 雑誌名: Prenatal Diagnosis 巻: 34 (4) ページ: 345-349
  • DOI: doi: 10.1002/pd.4307.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Single human papillomavirus 16 or 52 infection and later cytological findings in Japanese women with NILM or ASC-US. (2014)
  • 著者名/発表者名: Abe S, Miura K, Kinoshita A, Mishima H, Miura S, Yamasaki K, Hasegawa Y, Higashijima A, Jo O, Yoshida A, Kaneuchi M, Yoshiura K, Masuzaki H.
  • 雑誌名: Journal of Human Genetics 巻: 59 (5) ページ: 251-255
  • DOI: doi: 10.1038/jhg.2014.9.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Transforming growth factor beta1 (TGFβ1) polymorphisms and breast cancer risk. (2014)
  • 著者名/発表者名: Amani D, Khalilnezhad A, Ghaderi A, Niikawa N, Yoshiura KI.
  • 雑誌名: Tumor Biology 巻: 35 (5) ページ: 4757-4764
  • DOI: doi: 10.1007/s13277-014-1621-x.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Identification of endometrioid endometrial carcinoma-associated microRNAs in tissue and plasma. (2014)
  • 著者名/発表者名: Tsukamoto O, Miura K, Mishima H, Abe S, Kaneuchi M, Higashijima A, Miura S, Kinoshita A, Yoshiura K, Masuzaki H.
  • 雑誌名: Gynecologic Oncology 巻: 132 (3) ページ: 715-721
  • DOI: doi: 10.1016/j.ygyno.2014.01.029.
  • 査読あり
• [学会発表] 多発性歯牙腫合併症例を含むSATB2遺伝子変異症候群の新規変異の同定 (2014)
  • 著者名/発表者名: 三嶋博之，菊入 崇，三古谷 忠，木下晃，吉浦孝一郎
  • 学会等名: 第59回日本人類遺伝学会
  • 発表場所: タワーホール船堀（東京）
  • 年月日: 2014-11-19 – 2014-11-22
• [学会発表] 家族性肺がんにおける新規責任遺伝子の同定 (2014)
  • 著者名/発表者名: 朝重耕一，渡辺聡，三嶋博之，木下晃，松本桂太郎，及川将弘，宮崎拓郎，土谷智史，山崎直哉，福島喜代康，永安 武，吉浦孝一郎
  • 学会等名: 第59回日本人類遺伝学会
  • 発表場所: タワーホール船堀（東京）
  • 年月日: 2014-11-19 – 2014-11-22
• [学会発表] ddPCRを用い他McCune-Albright症候群のGNASモザイク変異検出の試み (2014)
  • 著者名/発表者名: 渡辺 聡，伊達木 澄人，中富明子，木下 晃，朝重耕一，木下英一，三嶋博之，森内浩幸，吉浦孝一郎
  • 学会等名: 第59回日本人類遺伝学会
  • 発表場所: タワーホール船堀（東京）
  • 年月日: 2014-11-19 – 2014-11-22
• [学会発表] anic障害多発家系例に対するExome解析 (2014)
  • 著者名/発表者名: 森本芳郎，小野慎治，森 貴俊，黒滝直弘，吉浦孝一郎，小澤寛樹
  • 学会等名: 第59回日本人類遺伝学会
  • 発表場所: タワーホール船堀（東京）
  • 年月日: 2014-11-19 – 2014-11-22
• [学会発表] 母体血漿中への妊娠関連胎盤特異的microRNAの流入量および分娩後の消失速度と陣痛との関連について (2014)
  • 著者名/発表者名: 森崎慎太郎，三浦清徳，東島 愛，阿部修平，三浦生子，長谷川ゆり，吉田 敦，金内優典，吉浦孝一郎，増崎英明
  • 学会等名: 第59回日本人類遺伝学会
  • 発表場所: タワーホール船堀（東京）
  • 年月日: 2014-11-19 – 2014-11-22
• [学会発表] 母体血と比較して胎児血で高発現するmicroRNAの同定 (2014)
  • 著者名/発表者名: 東島 愛，三浦清徳，三嶋博之，木下 晃，塚本大空，阿部修平，長谷川ゆり，吉田 敦，吉浦孝一郎，増崎英明
  • 学会等名: 第59回日本人類遺伝学会
  • 発表場所: タワーホール船堀（東京）
  • 年月日: 2014-11-19 – 2014-11-22
• [学会発表] 母体血漿中miR-517aおよびmiR518bは前置胎盤に対する帝王切開時の出血量に関連する (2014)
  • 著者名/発表者名: 長谷川ゆり，三浦清徳，東島 愛，阿部修平，三浦生子，吉田 敦，金内優典，吉浦孝一郎，増崎英明
  • 学会等名: 第59回日本人類遺伝学会
  • 発表場所: タワーホール船堀（東京）
  • 年月日: 2014-11-19 – 2014-11-22
• [学会発表] 母体血漿中cell-free microRNA 流入量と母体のbody mass indexおよび新生児出生体重との関連 (2014)
  • 著者名/発表者名: 渕 直樹，三浦清徳，東島 愛，長谷川ゆり，阿部修平，三浦生子，村上優子，三嶋博之，木下 晃，金内優典，吉浦孝一郎，増崎英明
  • 学会等名: 第59回日本人類遺伝学会
  • 発表場所: タワーホール船堀（東京）
  • 年月日: 2014-11-19 – 2014-11-22
• [学会発表] 双胎間輸血症候群発症予測における母胎血漿中胎盤特異的cell-free mRNA の有用性に関する検討 (2014)
  • 著者名/発表者名: 村上優子，三浦清徳，東島 愛，長谷川ゆり，阿部修平，三浦生子，三嶋博之，木下 晃，金内優典，吉浦孝一郎，増崎英明
  • 学会等名: 第59回日本人類遺伝学会
  • 発表場所: タワーホール船堀（東京）
  • 年月日: 2014-11-19 – 2014-11-22
• [学会発表] NILM/ASC-US例におけるHPV-16単独感染群とHPV-52単独感染群の細胞診所見の変化 (2014)
  • 著者名/発表者名: 阿部修平，三浦清徳，三浦生子，山崎健太郎，長谷川ゆり，東島 愛，吉田 敦，金内優典，吉浦孝一郎，増崎英明
  • 学会等名: 第59回日本人類遺伝学会
  • 発表場所: タワーホール船堀（東京）
  • 年月日: 2014-11-19 – 2014-11-22
• [学会発表] 単一遺伝子病の遺伝子診断 (2014)
  • 著者名/発表者名: 吉浦孝一郎
  • 学会等名: 第9回九州遺伝子診断研究会
  • 発表場所: 長崎大学医学部良順会館（長崎）
  • 年月日: 2014-09-27
  • 招待講演
• [学会発表] 中枢神経奇形を合併した複合型下垂体機能低下症の2例：trio exome 解析による新規原因遺伝子同定の試み (2014)
  • 著者名/発表者名: 渡辺聡，伊達木澄人，近河日智，中富明子，木下英一，吉浦孝一郎，深見真紀，緒方勤，森内浩幸
  • 学会等名: 第48回小児内分泌学会学術集会
  • 発表場所: アクトシティー浜松（浜松）
  • 年月日: 2014-09-25 – 2014-09-27
• [学会発表] 次世代シーケンサーで何が出来るのか (2014)
  • 著者名/発表者名: 吉浦孝一郎
  • 学会等名: 第23回日本組織適合性学会大会
  • 発表場所: 長崎大学医学部良順会館（長崎）
  • 年月日: 2014-09-14
  • 招待講演
• [学会発表] 幻覚・妄想を呈した正常圧水頭症の家族例の遺伝学的考察 (2014)
  • 著者名/発表者名: 森本芳郎，小野慎治，黒滝直弘，吉浦孝一郎，小澤寛樹
  • 学会等名: 第110回日本精神神経学会総会
  • 発表場所: パシフィコ横浜（横浜）
  • 年月日: 2014-06-26 – 2014-06-28
• [学会発表] digital PCR を利用した rare variant/mutation 検出法の検討 (2014)
  • 著者名/発表者名: 渡辺聡，朝重耕一，吉浦孝一郎，三嶋博之，木下晃
  • 学会等名: 第10回広島大学－長崎大学連携研究事業カンファランス
  • 発表場所: 長崎大学良順会館専斎ホール（長崎）
  • 年月日: 2014-05-31
• [学会発表] 「予防的乳房切除の今後」 特別企画1－1 遺伝子診断が医療にもたらすもの (2014)
  • 著者名/発表者名: 吉浦孝一郎
  • 学会等名: 第57回日本形成外科学会総会・学術集会
  • 発表場所: 長崎ブリックホール（長崎）
  • 年月日: 2014-04-09 – 2014-04-11
  • 招待講演
• [学会発表] 「小児血液・主要研究における全エキソーム解析の可能性」 次世代シーケンサーを用いた疾患解析法～総論 (2014)
  • 著者名/発表者名: 吉浦孝一郎
  • 学会等名: 第18回小児血液セミナー
  • 発表場所: ANAクラウンプラザホテル福岡（福岡市）
  • 年月日: 2014-04-05
  • 招待講演