| 研究課題/領域番号 |
25293128
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 研究機関 | 国立医薬品食品衛生研究所 |
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研究代表者 |
前川 京子 国立医薬品食品衛生研究所, 医薬安全科学部, 室長 (70270626)
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| 研究分担者 |
斎藤 嘉朗 国立医薬品食品衛生研究所, 医薬安全科学部, 部長 (50215571)
安達 基泰 独立行政法人日本原子力研究開発機構, 量子ビーム応用研究センター, 研究副主幹 (60293958)
谷内田 真一 独立行政法人国立がん研究センター, 研究所難治がん研究分野, ユニット長 (20359920)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | 酵素 / 癌 / 生理活性 |
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| 研究概要 |
「オーファンP450」に属するヒトCYP2U1、CYP4X1、CYP4Z1等は、腫瘍組織に高い発現が認められるものの、酵素機能が不明であり、高発現の病態生理学的意義が未解明である。本研究では、オーファンP450の酵素機能と分子構造学的特性の解明、及び腫瘍における高発現の病態生理学的意義の解明を目的として、①組み換え酵素を用いたin vitro機能解析・構造解析、②臨床試料を用いた発現解析・メタボローム解析を行う。
本年度は、まず大腸菌を宿主とし、CYP2U1、CYP4X1、CYP4Z1組換え酵素を発現するため、mRNA配列情報に基づき各オーファンP450のcDNAクローンを準備し、配列が正しいことを確認した。CYP2U1に関しては、すでに大腸菌を用いた大量発現に関する報告があるCYP2R1が、ヒトP450分子種の中でCYP2U1と最もアミノ酸レベルの相同性が高い（37.1%）ことから、これを参照して小胞体膜結合に関わるN末残基を除去し、C末にHisタグをつけたタンパクをコードするプラスミドを設計し、pCWori+ 発現ベクターにサブクローニングした。さらに、タンパクの大量発現に適した宿主大腸菌を選択するため、pCWori+ 発現ベクターにサブクローニングされたCYP2R1をポジティブコントロールとして、4種の大腸菌（DH5a, Rosetta, JM109, pGro7/BL21)を用いて発現を比較したところ、シャペロンを発現するpGro7/BL21において、CO差スペクトルにより、最も高い発現を認めた。
一方、ヒト臨床試料を用いた発現解析・メタボローム解析にあたり、主任研究者、及び分担研究者が所属する倫理審査委員会による必要な審査・機関の長の承認を得た。現在、解析に適した試料の収集を進めている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
ヒトCYP4Z1の発現が大腸菌に有毒であることが明らかになり、発現ベクターへのサブクローニングに時間を要している。
ヒト臨床試料を用いた発現解析・メタボローム解析にあたり、倫理審査委員会による必要な審査・機関の長の承認に時間を要した。
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| 今後の研究の推進方策 |
CYP4Z1に関しては、大腸菌に有毒なタンパクの発現に対応した発現ベクターを検討するか、バキュロウィルス-昆虫細胞系に発現系を変更する。実験補助のために、派遣研究者を５か月間雇用し、タンパク発現実験の効率化を図る。ヒト試料を用いた解析では、倫理委員会の承認が得られたことから、今後の組織の収集には、支障はないと考える。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
予定していた実体顕微鏡システムの購入を、平成25年度は不要であったため、先送りしたことから、次年度使用額が発生した。
平成25年度の未使用額は、平成26年度以降の物品費（消耗品、及び備品費）として使用する。
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