| 研究課題/領域番号 |
25293128
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| 研究機関 | 国立医薬品食品衛生研究所 |
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研究代表者 |
前川 京子 国立医薬品食品衛生研究所, 医薬安全科学部, 室長 (70270626)
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| 研究分担者 |
谷内田 真一 独立行政法人国立がん研究センター, 難治がん研究分野, ユニット長 (20359920)
斎藤 嘉朗 国立医薬品食品衛生研究所, 医薬安全科学部, 部長 (50215571)
安達 基泰 独立行政法人日本原子力研究開発機構, 原子力科学研究部門, サブリーダー (60293958)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | 酵素 / 癌 / 生理活性 |
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| 研究実績の概要 |
「オーファンP450」に属するヒトCYP2U1、CYP4X1、CYP4Z1は、腫瘍組織に高い発現が認められるものの、酵素機能が不明であり、高発現の病態生理学的意義が未解明である。本研究は、オーファンP450の酵素機能と分子構造学的特性の解明、及び腫瘍における高発現の病態生理学的意義の解明を目的として、①組み換え酵素を用いたin vitro機能解析・構造解析、②臨床試料を用いた発現解析・メタボローム解析を行う。
本年度は、pCW-LIC、pTrc, pET28a等の発現ベクターにCYP2U1、CYP4X1、CYP4Z1 cDNAをサブクローニングし、Rosetta2等の大腸菌を用いて組み換え酵素の大量発現を試みた。菌体の破砕・抽出時のcrudeな溶液中のAbsoluteスペクトルの測定により、CYP2U1、CYP4X1、CYP4Z1全ての組み換え酵素において500 nmol/L culture以上の高い発現を認めたものの、CO差スペクトルにおいて、450 nmに吸収が認められず、420nmに吸収極大が存在したことから、活性のないP420であることが判明した。N末の改変配列や大腸菌での発現時間等の条件を変更しても改善が認められなかったことから、大腸菌でのオーファンP450の発現には限界があると考え、次年度は、バキュロウイルス等を用いる方法への変更を検討している。
ヒト臨床試料を用いた発現解析、メタボローム解析では、海外からの報告によりオーファンP450が高く発現していることが明らかになっている乳がん患者の手術摘出組織を20症例収集した。メタボローム解析により、10種の酸化脂肪酸代謝物が、がん部と非がん部間での比較においてレベルの有意な相違を認めた。発現解析においては、組織からmRNAを抽出し、TaqMan法でのCYP2U1、CYP4X1、CYP4Z1の発現量の測定を開始した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
大腸菌を用いたオーファンP450の発現では、種々の条件検討を行ったものの、発現及び精製過程において、活性が消失したP420に変換してしまうことが明らかになり、活性を有するオーファンP450を得ることが困難であることが判明した。
ヒト臨床試料を用いた発現解析・メタボローム解析にあたり、倫理委員会により必要な審査・機関の長の承認に時間を有した。
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| 今後の研究の推進方策 |
実験補助のために、派遣研究者を６か月間雇用し、タンパク発現実験を大腸菌からバキュロウイルス-昆虫細胞系へと変更する。ヒト試料を用いた解析では、昨年度は20症例が収集でき、今年度も収集は継続できることから、今後の研究には支障がないと考える。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
予定していた実体顕微鏡のシステムの購入が、今年度は不要であり、先送りしたことから、次年度使用額が発生した。
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| 次年度使用額の使用計画 |
昨年度の未使用額は今年度の物品費及び人件費として、今年度に使用する。
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