アンチトロンビン-レジスタンスの分子病態解明とその血栓性素因マウスモデル創生解析

2013 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 25293129
• 研究種目: 基盤研究(B)
• 研究機関: 名古屋大学
• 研究代表者: 小嶋 哲人 名古屋大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (40161913)
• 研究分担者: 松下 正 名古屋大学, 医学部附属病院, 教授 (30314008) ; 高木 明 名古屋大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (30135371)
• 研究期間 (年度): 2013-04-01 – 2016-03-31
• キーワード: アンチトロンビン・レジスタンス（ATR） / トロンビン / プロトロンビン異常症 / 遺伝性血栓症 / R593Lプロトロンビン-マウス / 一塩基置換 / トロンボモジュリン／プロテインC経路 / 相同組換え

研究概要

本研究は、ごく最近我々の発見したアンチトロンビン・レジスタンス（ATR）を示すトロンビンを生ずるプロトロンビン異常症（c.1787G>T, p.R596L）の概念に基づき、原因不明の遺伝性血栓症例での新規ATR症例の検索とその遺伝子変異同定を行うとともに、組換え変異体解析による他のプロトロンビン変異体でのATR惹起性検索による新たなATR候補変異解析を行い、さらにR593L変異（ヒト分子596Rはマウス分子593Rに相当）プロトロンビンノックイン-マウス（R593Lプロトロンビン-マウス）の作製解析によりin vivo でのATRの病態解析を行い、血栓性素因・ATRの分子病態を解明することを目的とする。今年度は、血漿検体を用いた迅速ATR検出スクリーニング法（Murataら: Thromb Res. 2014）を用いたAT-R新規症例の検索とその遺伝子変異の同定解析を行ったところ、日本人家系でのATR検出例はなかったが、セルビア家系の遺伝性血栓症において新たなAT-R症例を検出した（Djordjevicら: JTH, 2013）。また、596Rの一塩基置換により生ずるミスセンス変異体でのAT-R惹起性スクリーニングでは、各組換え体由来の変異型トロンビンはTAT形成能が悪くATRを示すことが明らかとなった。一方、ATRプロトロンビン変異（R596L）の生理的凝固制御機構トロンボモジュリン／プロテインC経路への影響を検討したところ、変異型トロンビンはトロンボモジュリンによるフィブリン凝固抑制に抵抗性を示したが、プロテインC活性化亢進能は保たれていた（投稿準備中）。さらに、R593Lプロトロンビン-マウス用のターゲティングベクターを作製し、ES細胞での相同組換えにて得られたキメラマウス作製とC58BL6マウスを交配してヘテロマウスを得て、現在バッククロス中である。

現在までの達成度 (区分)

1: 当初の計画以上に進展している

理由

（理由）
当初計画より、R593L プロトロンビン-ノックインマウス作製が順調に進み、平成２６年度に予定していたキメラマウス引き渡しを今年度に受け、その経費を依頼先である大阪大学微生物病研究所 附属遺伝情報実験センター・遺伝子機能解析分野（発生工学研究会）に支払う必要性が生じたため、基金分の50万円の前倒し支払請求を必要とした。また、新たなATR症例を同定した。

今後の研究の推進方策

（今後の推進方策）
平成２６年度以降は、 新たなATR症例の検索とともに、R593L プロトロンビン-ノックインキメラマウスの交配により目的のR593Lプロトロンビン-マウス（ヘテロマウス）を作製し、さらにCre recombinase発現マウスと交配しNeo配列を取り除いたR593Lプロトロンビン-マウス（ヘテロおよびホモ）を作製する。

研究成果

• [雑誌論文] Development of a new laboratory test to evaluate antithrombin resistance in plasma. (2014)
  • 著者名/発表者名: Murata M, Takagi A, Suzuki A, Okuyama E, Takagi Y, Ando Y, Kato I, Nakamura Y, Murate T, Matsushita T, Saito H, Kojima T
  • 雑誌名: Thromb Res. 巻: 133 ページ: 293-298
  • DOI: doi: 10.1016/j.thromres.2013.11.021
  • 査読あり
• [雑誌論文] 1Current venous thromboembolism management and its outcomes in Japan: the nationwide JAVA observational study. (2014)
  • 著者名/発表者名: Nakamura M, Miyata T, Ozeki Y, Takayama M, Komori K, Yamada N, Origasa H, Satokawa H, Maeda H, Tanabe N, Unno N, Shibuya T, Tanemoto K, Kondo K, Kojima T.
  • 雑誌名: Circ J. 巻: 78 ページ: 708-717.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Impact of antithrombin deficiency on efficacy of edoxaban and antithrombin-dependent anticoagulants, fondaparinux, enoxaparin, and heparin. (2013)
  • 著者名/発表者名: Fukuda T, Kamisato C, Honda Y, Matsushita T, Kojima T, Furugohri T, Morishima Y, Shibano T
  • 雑誌名: Thromb Res. 巻: 131 ページ: 540-546
  • DOI: 10.1016/j.thromres.2013.04.016.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Molecular mechanisms of syndecan-4 upregulation by TNF-α in the endothelium-like EAhy926 cells. (2013)
  • 著者名/発表者名: Okuyama E, Suzuki A, Murata M, Ando Y, Kato I, Takagi Y, Takagi A, Murate T, Saito H, Kojima T
  • 雑誌名: J Biochem. 巻: 154 ページ: 41-50
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0071187.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Establishment of Mouse Model of MYH9 Disorders: Heterozygous R702C Mutation Provokes Macrothrombocytopenia with Leukocyte Inclusion Bodies, Renal Glomerulosclerosis and Hearing Disability. (2013)
  • 著者名/発表者名: Suzuki N, Kunishima S, Ikejiri M, Maruyama S, Sone M, Takagi A, Ikawa M, Okabe M, Kojima T, Saito H, Naoe T, Matsushita T
  • 雑誌名: PLoS One. 巻: 8 ページ: e71187
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0071187.
  • 査読あり
• [雑誌論文] A novel prothrombin mutation in two families with prominent thrombophilia- the first cases of antithrombin resistance in a Caucasian population. (2013)
  • 著者名/発表者名: Djordjevic V, Kovac M, Miljic P, Murata M, Takagi A, Pruner I, Francuski D, Kojima T, Radojkovic D
  • 雑誌名: J Thromb Haemost. 巻: 11 ページ: 1936-1939
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0071187.
  • 査読あり
• [学会発表] Genetic risk factors for thrombophilia in Japanese (2013)
  • 著者名/発表者名: Tetsuhito Kojima
  • 学会等名: Annual Meeting of Korean Society on Thrombosis and Haemostasis
  • 発表場所: Seoul, Korea
  • 年月日: 20130906-20130906
  • 招待講演
• [学会発表] A novel mechanism of hereditary thrombosis by antithrombin resistance. (2013)
  • 著者名/発表者名: Tetsuhito Kojima
  • 学会等名: XXIV Congress of nternational Society on Thrombosis and Haemostasis
  • 発表場所: Amsterdam, The Neterlands
  • 年月日: 20130629-20130704
  • 招待講演
• [図書] 改訂第8版 内科学書 Vol.６ 血液・造血器疾患、神経疾患（分担） (2013)
  • 著者名/発表者名: 小嶋哲人
  • 総ページ数: 493
  • 出版者: 中山書店
• [備考] 名古屋大学大学院医学系研究科 医療技術学専攻 病態解析学講座 分子病態解析学部門 血液・遺伝子研究室
  • URL: http://square.umin.ac.jp/bloodlab/Hematol_%26_Gene_Res_Lab/Welcome.html
• [備考] JAPANESE THROMBOPHILIA MUTATION DATABASE
  • URL: http://square.umin.ac.jp/bloodlab/Hematol_%26_Gene_Res_Lab/Japanese_Thrombophilia_mutation_database_%28JTMD%29.html
• [産業財産権] 血栓症のリスク検査法 (2013)
  • 発明者名: 高木明、小嶋哲人、高木夕希、村田萌
  • 権利者名: 国立大学法人名古屋大学
  • 産業財産権種類: 特許
  • 産業財産権番号: 特願2013-182541
  • 出願年月日: 2013-09-03