研究課題
基盤研究(B)
肝細胞への分化は、3つのステップ、すなわちヒトiPS細胞をアクチビンAにて内胚葉へ分化後、ジメチルスルホキシドにて肝細胞に分化、hepatocyte growth factorやオンコスタチンM、デキサメタゾンなどを添加し肝細胞の成熟を行った。しかし、十分に成熟が認められないことから、以下のような方法にて成熟した肝細胞への分化を試みた。１、三次元培養による成熟化：三次元培養法によるヒト肝臓を模したモデル形成を行い、ヒト生体でのin vitro微小肝臓モデルの構築を目的とした。トランスパレント社が開発した立体培養可能なプレート（Cell-able®）及び培地を用いて三次元培養を行い、成熟化に対する影響について検討した。その結果、三次元培養法によって肝細胞はスフェロイドを形成し、肝細胞マーカー及び主要な薬物代謝酵素であるCYP3Aの遺伝子発現は、二次元培養法と比較し顕著に高かった。また、三次元スフェロイド外膜はNTCPやOATP1B1を高発現し、肝臓血管側極性を示した。２、共培養による成熟化：Cell-ableにおいては3T3細胞と共培養を行うことで、細胞の接着率の向上が期待された。そこで、肝実質細胞と非実質細胞との共培養により、生体に近い肝臓構造を形成し、肝機能が向上するか検討を開始した。
2: おおむね順調に進展している
１、肝細胞への分化：ヒトiPS細胞から肝細胞へ分化誘導、hepatocyte growth factorやオンコスタチンM、デキサメタゾンなどを添加し、肝細胞の成熟を行ったが、十分に成熟が認められないことから、以下のような方法にて成熟した肝細胞への分化を試みた。２、三次元培養による成熟化：三次元培養法によるヒト肝臓を模したモデル形成を行い、ヒト生体でのin vitro微小肝臓モデルの構築を目的とした。トランスパレント社が開発した立体培養可能なプレート（Cell-able®）及び培地を用いて三次元培養を行い、成熟化に対する影響について検討した結果、三次元培養法によって肝細胞はスフェロイドを形成し、その遺伝子発現は、二次元培養法と比較し高かった。また、三次元スフェロイド外膜はNTCPやOATP1B1を高発現し、肝臓血管側極性を示した。１、2の検討については、当初の予定通り順調に進展していると考える。３、共培養による成熟化：肝実質細胞と非実質細胞との共培養により、生体に近い肝臓構造を形成するか検討を開始した。一方、iPS細胞から分化誘導した成熟肝細胞のuPA/SCIDマウス（免疫不全マウス）やTK-NOGマウスへの移植実験は現在計画中であるが、この検討については、当初の計画からはやや遅れているため、研究全体としてはおおむね順調に進展していると考える。
１、成熟肝細胞特異的に発現する転写制御因子及びmiRNAの探索とその制御：ヒト胎児肝細胞（未熟肝細胞）と成人肝細胞（成熟肝細胞）に発現する転写制御因子及びマイクロRNA（miRNA）をマイクロアレイにて網羅的に解析し、成熟に関与する転写制御因子及びmiRNAの候補をピックアップする。発現に関与する液性因子や低分子化合物、miRNA、siRNAを用いて成熟肝細胞と類似した発現プロファイルとなるよう制御することで、成熟化を試みる。２、免疫細胞を保持するヒト肝細胞キメラマウスを作製:第一段階として、HLA既知のiPS細胞から成熟肝細胞に分化させ、uPA/SCIDマウスに移植する。このiPS細胞由来ヒト肝細胞キメラマウスにHBV・HCVを感染後、iPS細胞に使用した同一個体由来の末梢血単核球(PBMC)を投与し、HBVに対する免疫応答が誘導されるかどうかを検証する。さらに、成熟肝細胞の誘導に使用したiPS細胞から、T細胞, NK細胞, またはNKT細胞など肝炎発症に重要な細胞へin vitroまたは別の個体で分化 (Watarai H et al. J Clin Invest. 2010参照)させ、HBV・HCVを感染させたiPS細胞由来ヒト肝細胞キメラマウスへ養子移入し、これらの免疫細胞による肝炎モデルが構築出来るかどうかを検討する。
計画当初予定していたiPS細胞から分化誘導した成熟肝細胞のuPA/SCIDマウスやTK-NOGマウスへの移植実験がやや遅れており、そのため予定していた費用の発生がなかったため。26年度には、遅れていたiPS細胞から分化誘導した成熟肝細胞のuPA/SCIDマウスやTK-NOGマウスへの移植実験を実施し、その費用を計上する予定である。
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