| 研究課題/領域番号 |
25293203
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 研究機関 | 山口大学 |
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研究代表者 |
神田 隆 山口大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (40204797)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | 血液神経関門 / ラミニン / ペリサイト / 内皮細胞 / 非細胞バリアー |
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| 研究概要 |
ヒト血液神経関門(blood-nerve barrier, BNB)を形成する微小血管の基底膜構成分子の全容を解明することを目的とし、ヒト生検末梢神経材料および剖検末梢神経組織を用いた免疫組織化学を行った。生検材料は文書による同意を得た生検腓腹神経10例の新鮮凍結標本で、基底膜成分に何らかの変化が起こる可能性のある炎症性・自己免疫性ニューロパチー症例は除外した。ヒト末梢神経組織に対する免疫組織化学は、研究代表者が確立した手技(Kanda et al. JNNP 75: 765-769, 2004)に準じて行った。剖検材料は文書による同意を得た脳血管障害例の坐骨神経凍結標本を用いた。また、対照としてBBB構成血管を含む脳血管障害例の剖検脳を用いた。候補分子をフィブロネクチン、コラーゲン type IV、ラミニン1-12で、ラミニンに関してはアイソフォームα4、α5を有するラミニン8, 9, 10, 11に絞り、同分子に対するIgG特異抗体を用いた解析を行った。免疫組織化学の結果は蛍光発色およびDAB染色の双方で確認した。
結果：BNB構成ヒト微小血管構成基底膜にはフィブロネクチン、コラーゲン type IVの存在が確認された。フィブロネクチン、コラーゲン type IVについてはBBB構成ヒト微小血管構成基底膜とほぼ同等の染色性がみられた。ラミニン・アイソフォームに関しては、ラミニン8,9の存在が疑われる免疫組織化学所見が得られた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究の最終ゴールは、BNBを構成する内皮細胞、血管周細胞に基底膜を加えたヒトBNBの三次元in vitroモデルを樹立することにある。ヒトBNB由来内皮細胞と血管周細胞に関しては我々の教室で樹立したものが既に存在しており、非細胞部分が完成すれば当初の目標は達成可能となる。本研究はまず、非細胞バリアーとしてのヒトBNB基底膜を構成する分子を把握することを初年度の主眼とした。BNB構成基底膜分子の免疫染色は世界的にも未着手の領域であり、抗体濃度などの条件設定に時間を要したがほぼ安定した結果が出るようになり、フィブロネクチン、コラーゲン type IVの存在の確認のほか、ラミニン8,9の存在の可能性を示すことができた。この結果を足掛かりとして次年度以降の研究へ結びつける布石ができたと考えている。
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| 今後の研究の推進方策 |
１．ヒト生検材料、剖検材料を用いた免疫組織化学をさらに進め、神経内膜内微小血管基底膜に発現する分子を明らかにする。コラーゲン・アイソフォームに関してはtype IV以外の分子の解析も進める。免疫組織化学で得られた知見をもとに、ヒト剖検末梢神経材料（坐骨神経）から研究代表者の確立した方法(Kanda et al. J Neurosci Res 1997)を用いて末梢神経微小血管分画を分離し、ウエスタンブロット法で発現する分子を同定する。第1の候補分子は上記免疫組織化学と同じくアイソフォームα4、α5を有するラミニン8, 9, 10, 11であるが、type IV以外のコラーゲン分子についても検索を進める。
２．上記解析から得られたBNB基底膜構成分子の定量的データをもとに、各分子を混合したBNBマトリックスの作成を試みる。
３．BNBマトリックスは各構成分子の比率を変化させたものを複数作成する。BNBマトリックスをBoyden Chamberに塗布し、BNB由来内皮細胞を上面に、BNB由来血管周細胞を底面に播種したBNB in vitroモデルを作成、最も強固なバリア機能を示すマトリックス比率をTEER、イヌリン・クリアランス、内皮細胞でのclaudin-5の発現量の３つのパラメーターをもとに決定する。
４．上記３の実験完成を待って第2のプロジェクト、BNB三次元in vitroモデルを用いて内皮細胞上の各種influx, effluxトランスポーター、レセプターの発現を網羅的に解析する作業に移る。この研究は連携研究者（寺崎）の協力を得て、Multiple Reaction Monitoring Modeの質量分析装置を用いることで同細胞の細胞膜タンパク質の高感度・網羅的な定量的解析を行うものである。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
当初の計画で末梢神経の免疫組織化学と蛋白解析の両方に対する予算を主に消耗品として計上していた。蛋白解析は免疫組織化学の結果を受けて開始する予定であったので、初年度は蛋白解析に至らず同実験の施行にあたっての予算（主に消耗品）が執行されなかった。
平成26年度に蛋白解析実験を組み込み、1,195,492円を同解析用のモノクロナル抗体購入（約50万円）、ガラス器具（約20万円）、薬品（約30万円）、その他（約19.5万円）の配分で平成26年の予算と合わせて使用する予定である。
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