人工ヌクレアーゼによる食細胞異常症由来ヒトiPS細胞の遺伝子修復に関する研究

2013 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 25293231
• 研究種目: 基盤研究(B)
• 研究機関: 広島大学
• 研究代表者: 小林 正夫 広島大学, 医歯薬保健学研究院, 教授 (00162016)
• 研究分担者: 山本 卓 広島大学, 理学(系)研究科(研究院), 教授 (90244102) ; 津村 弥来 広島大学, 医歯薬保健学研究院, 研究員 (80646274) ; 中村 和洋 広島大学, 医歯薬保健学研究院, 准教授 (70363059)
• 研究期間 (年度): 2013-04-01 – 2016-03-31
• キーワード: 遺伝子修復 / iPS細胞 / 先天性好中球減少症 / TALEN

研究概要

健常人由来iPS細胞と先天性好中球減少症（SCN）患者由来iPS細胞を用いて，造血系特にCD34への分化を行い，CD34でソーティング後に骨髄顆粒球系への分化を行った。フィーダー細胞の有無で若干の違いはあるものの，健常人由来iPS細胞からはサイトカイン存在下で安定的に好中球系への分化を誘導することが可能となった。誘導された好中球の性質は細胞内酵素発現，表面抗原発現，好中球活性酸素産生能から，末梢血好中球とほぼ同等であることを確認した。また，SCN患者由来iPS細胞では骨髄顆粒球系細胞への分化誘導では患者骨髄でみられる前骨髄球での成熟障害を確認することが出来，患者病態を再現できていることが明らかとなったから，病態解析に応用することが可能となった。
人工ヌクレアーゼtranscription activator-like effector nucleases (TALENs)は研究分担者の山本教授により，デザインと作製を行った。正常iPSには変異ELANEを，患者由来iPS細胞には正常ELANE遺伝子の導入を試みた。遺伝子導入はelectroporation法で行い，導入の可否はサザンブロッティングにて確認を行った。導入の成否とその効率は現段階では一定していないが，いくつかのクローンでは導入を確認している。現在，導入が成功しているiPS細胞クローンの分化誘導を開始している。骨髄顆粒球系への分化誘導により，SCNの病態反映とSCN由来iPS細胞の遺伝子修復を確認することが可能となるので，検討を継続している。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

iPS細胞の血液細胞，特に骨髄顆粒球系細胞への分化過程はほぼ確立された。また人工ヌクレアーゼ　TALENの設計と作製，ならびにiPS細胞への導入，発現も効率は良くないものの概ね達成できている。一部のiPS細胞クローンにおいて，変異ELANE，正常ELANEの導入が出来ているので，今後はそのiPS細胞クローンから造血細胞への分化を検討していく予定である，以上，本研究課題の遂行は概ね順調に進んでいる。

今後の研究の推進方策

人工ヌクレアーゼTALENの設計と導入ならびに発現は，徐々に成功してきている段階であるので，遺伝子導入の効率を上げる工夫が重要な課題である。一部の実験では，いくつかのiPS細胞クローンで，正常iPS細胞での変異ELANEの導入，ならびに患者由来iPS細胞での正常ELANEの発現を確認しているので，これらのクローンを用いて，骨髄顆粒球細胞への分化誘導実験を開始している。分化誘導後に健常人由来iPSからのSCNの病態反映，SCN由来するiPS細胞の遺伝子修復を確認することが本研究課題の重要てーまであるので，検討を継続していく。また，iPS細胞を用いたマウスモデル作製を平行しているので，iPS細胞からのCD34細胞の免疫不全マウスへの異種間移植による，ヒト細胞の生着確認を反復して行う。ヒト細胞が同定できるための実験を継続していく予定である。

次年度の研究費の使用計画

消耗品費をすべて使用するに至りませんでしたが，先天性好中球減少症（SCN）の遺伝子修復ならびにSCNの遺伝子異常の発現に関する研究は順調に進行している。また国内外の学会発表も一部で行うことが出来ている。本研究テーマの基礎的条件が確立されて来ているので，次年度は遺伝子異常疾患を拡大し，修復すべき遺伝子のデザインの増加，iPS細胞株の培養の拡大，免疫不全マウスへの移植実験の増加が予想されるので，消耗品費を次年度に繰り越すこととした。
先天性好中球減少症でのELANE変異導入と修復のためのTALEN作製は可能となり，遺伝子修復のための基礎的技術は確立されつつある。次年度は同疾患での他の遺伝子異常の修復のための人工ヌクレアーゼのデザインの拡大とiPS細胞株を増加して検討し，修復と病態発現されたiPS細胞のクローン選別とこのクローン由来のCD34細胞の免疫不全マウスへの移植を予定している。マウスを用いた実験での確認は長期間の観察が必要であること，多くのマウス購入と飼育に関して，当初の計画予算よりは多くの消耗品費の出費が予想される。

研究成果

• [雑誌論文] Simple diagnosis of STAT1 gain-of-function alleles in patients with chronic mucocutaneous candidiasis. (2014)
  • 著者名/発表者名: Mizoguchi Y, Tsumura M, Okada S, Hirata O, Minegishi S, Imai K, Hyakuna N, Muramatsu H, Kojima S, Ozaki Y, Imai T, Takeda S, Okazaki T, Ito T, Yasunaga S, Takihara Y, Bryant VL, Kong XF, Cypowyj S, Boisson-Dupuis S, Puel A, Casanova JL, Morio T, Kobayashi M
  • 雑誌名: Journal of Leukocyte Biology 巻: 95 ページ: 667-676
  • DOI: 10.1189/jlb.0513250
  • 査読あり
• [雑誌論文] Genetic correction of HAX1 in induced pluripotent stem cells from a patient with severe congenital neutropenia improves defective granulopoiesis (2014)
  • 著者名/発表者名: Morishima T, Watanabe K, Niwa A, Hirai H, Saida S, Tanaka T, Kato I, Umeda K, Hiramatsu H, Saito M, Matsubara K, Adachi S, Kobayashi M, Nakahata T, Heike T
  • 雑誌名: Haematologica 巻: 99 ページ: 19-27
  • DOI: 10.3324/haematol.2013.083873. Epub 2013 Aug 23.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Identification of the integrin β3 L718P mutation in a pedigree with autosomal dominant thrombocytopenia with anisocytosis. (2013)
  • 著者名/発表者名: Kobayashi Y, Matsui H, Kanai A, Tsumura M, Okada S, Miki M, Nakamura K, Kunishima S, Inaba T, Kobayashi M
  • 雑誌名: British Journal of Haematology 巻: 160 ページ: 521-529
  • DOI: 10.1111/bjh.12160. Epub 2012 Dec 17
  • 査読あり
• [雑誌論文] Wnt3a stimulates maturation of impaired neutrophils developed from severe congenital neutropenia-derived pluipotent stem cells with heterozygous ELANE mutation. (2013)
  • 著者名/発表者名: Hiramoto T, Ebihara Y, Mizoguchi Y, Nakamura K, Yamaguchi K, Ueno K, Mochizuki S, Yamamoto S, Nagasaki M, Furukawa Y, Tani K, Nakauchi H, Kobayashi M, Tsuji K
  • 雑誌名: Proc Natl Acad Sci USA 巻: 110 ページ: 3023-3028
  • DOI: 10.1073/pnas.1217039110. Epub 2013 Feb 4.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Heterozygosity for the Y701C STAT1 mutation in a multiplex kindred with multifocal osteomyelitis. (2013)
  • 著者名/発表者名: Hirata O, Okada S, Tsumura M, Kagawa R, Miki M, Kawaguchi H, Nakamura K, Boisson-Dupuis S, Casanova JL, Takihara Y, Kobayashi M
  • 雑誌名: Haematologica 巻: 98 ページ: 1641-1649
  • DOI: 10.3324/haematol.2013.083741. Epub 2013 Apr 12
  • 査読あり
• [雑誌論文] Naïve and memory human B cells have distinct requirements for STAT3 activation to differentiate into antibody-secreting plasma cells. (2013)
  • 著者名/発表者名: Deenick EK, Avery DT, Chan A, Berglud LJ, Ives ML, Bustamante J, Boisson-Dupuis S, Tsumura M, Kobayashi M, Arkwright PD, Averbuch D, Engelhard D, Roesler J, Peake J, Wong M, Adelstein S, Choo S, Smart JM, French MA, Fulcher DA, Cook MC, Picard C, Durandy A, Klein C, Holland SM, Uzel G, Casanova JL, Ma CS, Tangye SG
  • 雑誌名: Journal of Experimental Medicine 巻: 210 ページ: 2739-2753
  • DOI: 10.1084/jem.20130323. Epub 2013 Nov 11
  • 査読あり
• [雑誌論文] Signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) mutations underlying autosomal dominant hyper-IgE syndrome impair human CD8(+) T-cell memory formation and function. (2013)
  • 著者名/発表者名: Ives ML, Ma CS, Palendira U,Chan A, Bustamante J, Boisson-Dupuis S, Arkwright PD, Engelhard D, Averbuch D, Magdorf K, Roesler J, Peake J, Wong M, Adelstein S, Choo S, Smart JM, Frnch MA, Fulcher DA, Cook MC, Picard C, Durandy A, Tsumura M, Kobayashi M, Uzel G, Casanova JL, Tangye SG, Deenick EK
  • 雑誌名: Journal of Allergy and Clinical Immunology 巻: 132 ページ: 400-411
  • DOI: 10.1016/j.jaci.2013.05.029. Epub 2013 Jul 4
  • 査読あり
• [雑誌論文] : IL-21 signalling via STAT3 primes human naïve B cells to respond to IL-2 to enhance their differentiation into plasmablasts. (2013)
  • 著者名/発表者名: Berglund LJ, Ma CS, Avery DT, Moens L, Deenick EK, Bustamante J, Boisson-Dupuis S, Wong M, Adelstein S, Arkwright PD,Fulcher DA, Ziegler JB, Smart JM, Kobayashi M, Casanova JL, Cook MC, Uzel G, Tangye SG
  • 雑誌名: Blood 巻: 122 ページ: 3940-3950
  • DOI: 10.1182/blood-2013-06-506865. Epub 2013 Oct 24.
  • 査読あり
• [学会発表] Genetic characteristic of patients with severe congenital neutropenia in Japan. (2013)
  • 著者名/発表者名: Masao Kobayashi, Yoko Mizoguchi, Shuhei Karakawa, Satoshi Okada, Hiroshi Kawaguchi, Kazuhiro Nakamura
  • 学会等名: 27th International Congress of Pediatrics
  • 発表場所: Melbourne, Australia
  • 年月日: 20130824-20130829