人工ヌクレアーゼによる食細胞異常症由来ヒトiPS細胞の遺伝子修復に関する研究

2014 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 25293231
• 研究機関: 広島大学
• 研究代表者: 小林 正夫 広島大学, 医歯薬保健学研究院(医), 教授 (00162016)
• 研究分担者: 津村 弥来 広島大学, 医歯薬保健学研究院(医), 研究員 (80646274) ; 山本 卓 広島大学, 理学(系)研究科(研究院), 教授 (90244102) ; 岡田 賢 広島大学, 大学病院, 助教 (80457241)
• 研究期間 (年度): 2013-04-01 – 2016-03-31
• キーワード: 遺伝子編集 / iPS細胞 / 人工ヌクレアーゼ / 先天性好中球減少症

研究実績の概要

先天性好中球減少症患者（ELANE変異）の骨髄細胞から疾患特異的iPS細胞を樹立し，造血系への分化過程を確立した。患者骨髄細胞で認められる，骨髄顆粒球系分化での成熟障害，増殖能の低下をiPS細胞からの骨髄顆粒球系細胞でも同様の所見であることを確認することができた。本課題で樹立した疾患特異的iPS細胞で，患者に認められている病態を反映できることが明らかとなり，更なる病態解明の研究に利用する事が可能となった。そこで，まずは正常iPS細胞において遺伝子編集技術を用いて，作製された人工ヌクレアーゼ（TALEN)で遺伝子操作を行い，患者と同じ変異の導入を行い，造血系への分化を検討した。正常iPS由来骨髄顆粒球系と変異iPS細胞由来の骨髄顆粒球系細胞で細胞の増殖，分化が全く異なることが明らかとなった。遺伝子編集を行うことで，正常iPS細胞から患者iPS細胞を作製できる可能性が示された。現在，患者由来iPS細胞での変異を修復するためのTALENを作製し，遺伝子修復が可能かどうかを検討している。
また，正常iPS細胞から遺伝子操作で作製できた変異をもつiPS細胞を免疫不全マウスに移植実験を行っているが，完全な生着を得ることはできていない。変異iPS細胞から造血系に分化した細胞数が十分でない可能性があり，細胞数を増やした培養系で検討している。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

疾患特異的iPS細胞の分化実験，正常iPS細胞に遺伝し編集で変異を導入できることが明らかとなっていることから，予定通りに研究は進行していると考えている。

今後の研究の推進方策

計画で考えている内容が順調に遂行されているので，最終目標である患者由来のiPS細胞での遺伝子編集から，遺伝種修復が可能となるかどうかを今後の1年で明らかとする予定である。

研究成果

• [雑誌論文] Mosaicism of an ELANE mutation in an asymptomatic mother in a familial case of cyclic neutropenia. (2015)
  • 著者名/発表者名: Hirata O, Okada S, Ttsumura M, Karakawa S, Matsumura I, Kimura Y, Mihara T, Yasunaga S, Takihara Y, Ohara O, Kobayashi M
  • 雑誌名: Journal of Clinical Immunology 巻: 2015 ページ: 1-5
  • DOI: 10.1007/s10875-015-0165-1
  • 査読あり
• [雑誌論文] Genetic correction of HAX1 in induced pluripotent stem cells from a patient with severe congenital neutropenia improves defective granulopoiesis. (2014)
  • 著者名/発表者名: Morishima T, Watanabe K, Niwa A, Hirai H, Saida S, Tanaka T, Kato I, Umeda K, Hiramatsu H, Saito MK, Matsubara K, Adachi S, Kobayashi M, Nakahata T, Heike T
  • 雑誌名: Haematologica 巻: 99 ページ: 19-27
  • DOI: 10.3324/haematol.2013.083873
  • 査読あり
• [雑誌論文] Simple diagnosis of STAT1 gain-of-function alleles in patients with chronic mucocutaneous candidiasis. (2014)
  • 著者名/発表者名: Mizoguchi Y, Tsumura M, Okada S, Hirata O, Minegishi S, Imai K, Hyakuna N, Muramatsu H, Kojima S, Ozaki Y, Imai T, Takeda S, Okazaki T, Ito T, Yasunaga S, Takihara Y, Bryant VL, Kong XF, Cypowyj S, Boisson-Dupuis S, Puel A, Casanova JL, Morio T, Kobayashi M
  • 雑誌名: Journal of Leukocyte Biology 巻: 95 ページ: 667-676
  • DOI: 10.1189/jlb.0513250
  • 査読あり
• [雑誌論文] Detection of Mucor velutinosus in a blood culture after autologous peripheral blood stem cell transplantation: a pediatric case report. (2014)
  • 著者名/発表者名: Joichi Y, Chijimatsu I, Yarita K, Kamei K, Miki M, Onodera M, Harada M, Yokozaki M, Kobayashi M, Ohge H
  • 雑誌名: Medical Mycology Journal 巻: 55 ページ: E43-48
  • DOI: org/10.3314/mmj.55.E43
  • 査読あり
• [雑誌論文] A 2-year-old Japanese girl with TNF receptor-associated periodic syndrome: A case report of the youngest diagnosed proband in Japan. (2014)
  • 著者名/発表者名: Yasumura J, Wago M, Okada S, Nishikomori R, Takei S, Kobayashi M
  • 雑誌名: Modern Rheumatology 巻: 20 ページ: 1-4
  • 査読あり
• [学会発表] Excessive Nitric Oxide production of CGD neutrophils induces the down-regulation of NOS3 and EDN1 expression in human endothelial cells. (2014)
  • 著者名/発表者名: Akari N. Utsunomiya, Miyuki Tsumura, Norioki Ohno, Mizuka Miki, Hiroshi Kawaguchi, Kazuhiro Nakamura and Masao Kobayashi
  • 学会等名: The 56th American Society of Hematology Annual Meeting and Exposition
  • 発表場所: San Francisco, CA, USA
  • 年月日: 2014-12-06 – 2014-12-09
• [学会発表] STAT1 gain-of-function in patients with chronic mucocutaneous candidiasis can be detected by the excessive phosphorylation of STAT1 in peripheral blood monocytes. (2014)
  • 著者名/発表者名: Yoko Mizoguchi, Satoshi Okada, Miyuki Tsumura, Osamu Hirata, Shizuko Minegishi, Jean-Laurent Casanova, Tomohiro Morio, Masao Kobayashi
  • 学会等名: The 56th American Society of Hematology Annual Meeting and Expositio
  • 発表場所: San Francisco, CA, USA
  • 年月日: 2014-12-06 – 2014-12-09
• [学会発表] Siginificant augmentation of regulatory T cells in early neonatal period. (2014)
  • 著者名/発表者名: Seiich Hayakawa, Seiko Maeno, Norioki Ohno, Satoshi Okada, Yutaka Nishimura, Michiko Hayashidani, Masao Kobayashi
  • 学会等名: 16th Biennial Meeting of the European Society for Immunodeficiencies
  • 発表場所: Prague, Czech
  • 年月日: 2014-10-29 – 2014-11-01
• [学会発表] Early elimination of Factor VIII inhibitor by ITI with high dose immunoglobulin in hemophilia A children. (2014)
  • 著者名/発表者名: Yoko Mizoguchi, Aya Furue, Ikue Chijimatsu, Mizuka Miki, Keita Tomioka, Nakao Konishi, Atsushi Ono, Hiroshi Kawaguchi, Kazuhiro Nakamura and Masao Kobayashi
  • 学会等名: WORLD FEDERATION OF HEMOPHILIA, 2014 World Congress
  • 発表場所: Melbourne, Australia
  • 年月日: 2014-05-11 – 2014-05-15