研究課題
基盤研究(B)
新しいスパイン形成制御のメカニズムとして、Rhebと結合したsynteninがプロテアソームによって分解される結果、CASKがsyndecan-2と結合し、スパイン形成を起こすことを明らかにしている。この経路が結節性硬化症では障害されており、蓄積したsynteninがsyndecan-2と結合するため、スパイン形成が抑制されることを見出している。そこで、本年度は、Tsc2(+/-)ラットにおけるsynteninの病態学的役割を検証した。１) Syntenin siRNAの導入によるin vivoスパイン形成の回復：Tsc2(+/-)ラットの脳内にsyntenin siRNAを電気穿孔法により導入し、スパイン形成が促進されることをdiolistic法により確認した。標識された神経細胞の樹状突起を撮像し、樹状突起スパインの巾・長さ・密度などをscrambled siRNA間で比較したところ、巾は広く、長さが短いキノコ型スパインに変化していることが分かった。２) Syntenin siRNAの脳室内注入による異常行動の改善：Tsc2(+/-)ラットは、文脈依存的恐怖弁別学習の異常を示すが、Tsc2(+/-)ラットの脳室内にsyntenin siRNAを持続注入したところ、この異常が改善されることを確認した。
2: おおむね順調に進展している
計画通り、Tsc2(+/-)ラットのスパイン形成異常がsynteninのノックダウンにより改善することを検証できたため。
１）Tsc2(+/-)マウスの発作原性Tsc2(+/-)マウスとsyntenin(+/-)マウスを交配し、Tsc2(+/-)マウスのスパイン形成が改善されるかどうかを初代培養および脳切片を用いて検証する。次に、Tsc2(+/-)マウスが野生型に比べててんかん発作を起こしやすいかどうかを検証するため、化学的キンドリング実験を行う。ペンチレンテトラゾールを連続投与し、発作の進展過程を野生型と比較する。さらに、このマウスのsynteninをノックアウトすることにより、発作原性が抑えられるかどうかを検証する。また、キンドリング後の海馬神経細胞脱落やグリオーシスの程度も相互に比較する。２）West症候群のモデルマウス作成結節性硬化症の原因となるTsc遺伝子あるいは大田原症候群からWest症候群を起こすCASK遺伝子のノックアウトマウスを作成する。まず脳全体でこれらの遺伝子をホモノックアウトする予定だが、もし成獣になる前に死ぬ場合は、脳の部位特異的ノックアウト作成を試みる。これらのfloxedマウスを海馬特異的にCreを発現するマウス（Pomc-cre）と交配し、ホモノックアウトマウスを得る。交配で得られたPomc-Tsc1(-/-)あるいはpomc-CASK(-/-)マウスを用いて、自発性のてんかん発作が生じているかを行動学的および深部脳波記録（海馬に記録電極を刺入）から判断し、その頻度・程度などを定量的に解析する。
当初予定していた計画が予定より順調に進捗したため、物品費が減ったこと。また、計画の進捗を優先し、発表を次年度以降に先延ばししたため。差額分は次年度以降へ回し、有効に活用する。物品費:試薬120万円（培養関連50万円、免疫組織用（抗体含む）70万円）、実験動物（トランスジェニックマウスの購入費含む）200万円、理化学（電気生理用含む）100万円旅費：国内学会（3－4回）20万円その他：動物輸送費、英文校正、学会年会費・参加費、手数料など 10万円
すべて 2014 2013 その他
すべて 雑誌論文 (5件) (うち査読あり 4件) 学会発表 (6件) (うち招待講演 1件) 産業財産権 (1件)
J Neurochem.
巻: 128 ページ: 246-55
10.1111/jnc.12470
BioMed. Res. Int.
巻: 2013 ページ: 564534
10.1155/2013/564534
World J. Neurol.
巻: 3 ページ: 138-143
10.5316/wjn.v3.i4.138
巻: 3 ページ: 56-61
10.5316/wjn.v3.i3.56.
日本薬理学雑誌
巻: 142 ページ: 106-111
