| 研究課題/領域番号 |
25293240
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| 研究機関 | 京都府立医科大学 |
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研究代表者 |
伊東 恭子 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (80243301)
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| 研究分担者 |
藤森 亮 独立行政法人放射線医学総合研究所, 放射線防護研究センター、リスク低減化研究プログラム、感受性モデル動物研究チーム, チームリーダー (50314183)
伏木 信次 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (80150572)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | 先天異常学 / 細胞周期 / Aspm |
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| 研究実績の概要 |
I. 条件的Aspm欠損マウス(Fucci-Nes-CreERT2- Aspmflox)の脳形成の解析
胎齢8.5日、9.5日において、母マウスにタモキシフェン(以下、TAM) を8mg（総量）経口投与し、胎仔脳においてAspmノックダウンを惹起した。TAM投与後の胎仔死亡率は39%（47/122）であったが、生存した胎仔のうちgenotype：CreERT2(+)+flox/floxの胎仔脳において Aspm mRNAの有意な発現低下（RT-PCR）、Aspm蛋白発現低下（免疫染色）を確認した。当該胎仔脳を用いて、12.5日～14.5日まで終脳の形成を解析した。増殖・分裂に及ぼす影響を解析するために、EdU投与（10 mg/kg）1時間後の脳室層、脳室下層におけるEdU陽性細胞、分裂中期の細胞に関して、その分布・細胞数を計測した。CreERT2(+)+flox/flox（ホモAspm発現欠損）、CreERT2(-)（Aspm正常発現コントロール）、ならびにCreERT2(+)+flox/+（ヘテロAspm発現欠損）の3群間で比較検討中である。EdU陽性細胞の分布、細胞数に有意差はみられず、S期におけるDNA合成に影響はないが、分裂中期細胞の細胞分布・数に差異がみられ、今後さらに検討を続ける予定である。
II. Aspm欠損マウスの脳形成の解析
生後3-4週、ならびに生後10-12週において、同一個体でMRI画像(T2強調、拡散テンソル画像)を取得し、大脳皮質、海馬、脳室容積、神経回路の経時的な変化を解析している。Aspm欠損マウス(-/-)のメスでは、WT(+/+)に比較し、進行性の脳室拡大がみられるとともに、拡散テンソル画像でFA（fractional anisotrophy）値の差異がみられ、画像解析後（13-15週）に脳の組織学的解析を加え、その組織学的確証を解析中である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
1. 条件的Aspm欠損マウス(Fucci-Nes-CreERT2- Aspmflox)の脳形成の解析では、タモキシフェン(以下、TAM)投与条件の設定に難渋した。TAMの母仔に対する毒性が強く、胎仔脳におけるAspmのノックダウン誘導に至適な投与時期、投与量の設定に苦慮した。
2. 継代とともに、Fucciのライヴ蛍光が低下しており、新規のFucciマウス（R26Fucci2aR: G1期をmVenus、S/G2/M期をmCherryでラベル）との交配を開始した。
以上の問題が発生したため、研究の遂行が遅れている。
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| 今後の研究の推進方策 |
1. 中枢神経特異的Aspm欠損マウス(NesCre- Aspmflox)の脳形成の解析
タモキシフェン(以下、TAM)誘導型Aspm遺伝子破壊マウスの脳形成解析が順調に進まないため、中枢神経特異的Aspm欠損マウス(NesCre- Aspmflox)を用いて、Aspmの機能解析を並行して進める。EdU投与により、細胞増殖、細胞遊走、分化に着目した解析を行う。
2. 条件的Aspm欠損マウス(Fucci-NesCreERT2- Aspmflox)の新規作製と脳形成解析
新規のFucciマウス（R26Fucci2aR: G1期をmVenus、S/G2/M期をmCherryでラベル）と条件的Aspm欠損マウス（NesCreERT2- Aspmflox)の交配により、ライヴ蛍光を改善した遺伝子改変マウスの作製を遂行する。新規遺伝子改変マウスを用いて、胎齢8.5日、9.5日において、TAM投与により、Aspmノックダウンを惹起し、胎齢12.5日～16.5日まで終脳の形成を解析する。脳室層、脳室下層におけるG1期、S/G2/M期の細胞動態観察を継続する。タイムラプスによる細胞周期解析では、胎齢8.5日、9.5日にTAM投与後、胎齢13.5日に取り出した胎仔終脳壁の組織培養を行い、共焦点レーザ顕微鏡下、タイムラプスで一細胞レベルにおけるG1期、S/G2/M期の移行を24時間～48時間観察する。細胞周期、対称性、非対称性分裂の動態に関して解析する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
条件的Aspm欠損マウス(Fucci-Nes-CreERT2- Aspmflox)の脳形成の解析において、タモキシフェン(以下、TAM)投与条件の設定に難渋した。そのため実験がやや遅延し、免疫染色関連試薬の購入を一時延期した。
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| 次年度使用額の使用計画 |
実験が順調に進む方向性が得られたため、免疫染色関連試薬の購入に使用する。
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