| 研究課題/領域番号 |
25293245
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| 研究機関 | 愛媛大学 |
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研究代表者 |
佐山 浩二 愛媛大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (80187286)
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| 研究分担者 |
藤山 幹子 愛媛大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (60263935)
白石 研 愛媛大学, 医学部附属病院, 講師 (80710863)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | 自然免疫 / 表皮角化細胞 / TGF-beta / インフラマソーム / アレルギー |
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| 研究実績の概要 |
培養角化細胞のインフラマソーム活性化にTGF-β、Smurf/Arkadiaが関与しているかどうかを解析する。また、KOマウスを作成し、KOマウスの表現型の解析を行う。
１．角化細胞のインフラマソーム活性化のTGF-βによる抑制。TGF-β刺激でインフラマソームの活性化が抑制されるかどうか、TGF-βの前処理後、刺激し反応が減弱するかどうか検討した。その結果、IL-1βの産生は低下していた。
２． Smadシグナルの解析。培養角化細胞を刺激後にSmadシグナルを解析した。角化細胞を刺激後に細胞抽出液を作成し抗Smad2/3、抗リン酸化Smad2/3抗体を用いてWestern blotを行った。ネガティブフィードバックとして産生されるSmad7の産生はRT-PCR， Western blotにて確認した。その結果Smad2/3はリン酸化され、Smad7の発現は亢進した。Smadシグナルの制御因子として知られているSmurf，Arkadiaの発現を刺激後にRT-PCR，Western blot法にて検討した。その結果、Smurfの発現は増強したが、Arkadiaの発現は変化しなかった。
３． Smurfの機能解析。レンチウイルスベクターを用いて培養角化細胞のSmurfをノックダウンし、Smadシグナルを解析した。その結果、Smurf 1/2 両方のノックダウンでは Smad 2/3のリン酸化が亢進し、Smad7の発現が増強した。
４． KOマウスの解析。TGF-βシグナルは細胞の増殖・分化も制御しておりKOマウスは表皮の構築にも異常を来している可能性がある。Smurf 2 KO マウスを臨床的に評価したが外観上は著変を認めなかった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
角化細胞のSmadシグナルの解析、およびインフラマソーム活性化の解析はほぼ予定どおり進行している。さらに培養細胞のおける解析のために必要なSmurf 1/2 レンチウイルスベクターを用いた解析はすでに進行中である。Arkadiaレンチウイルスベクターは現在作成中である。また、Smurf 2 KOマウスはすでに準備できている。
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| 今後の研究の推進方策 |
平成26年度に引き続いて培養角化細胞のインフラマソームの解析、およびSmurf，Arkadia KOマウスを作成しその表現型の解析を行う。さらにSmurf，Arkadiaの発現を臨床的に解析する。
１ 培養角化細胞を用いた解析。角化細胞のインフラマソーム活性化のTGF-βによる抑制。Smadシグナルの解析。Smurf, Arkadiaの機能解析。
２ KOマウスの解析。表皮角化細胞の増殖と分化に影響がでていないか確認する。臨床的に評価した後、組織学的にはパラフィン切片を用いたHE染色で皮膚の分化異常を確認する。さらに、分化マーカーの発現を免疫組織学的に検討する。
３ 臨床的なSmurf，Arkadia発現の検討。診断のためにすでに採取してある病理組織標本を用いて発現を検討する。アトピー性皮膚炎の病態に角化細胞インフラマソーム活性化は重要なので、患者病変部の皮膚を免疫組織学的に染色する。Smurf, Arkadia, NLRP3, ASC, Caspase-1, IL-18, IL-33に対する抗体を用いる。さらに、創傷、乾癬などの皮膚炎症部位ではTGF-βが増加し、その結果角化細胞の増殖が亢進しリンパ球浸潤を来すとされており、同様に検討する。
４ 3年間で得られた結果をとりまとめ、成果の発表を行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
Smurf 1/2 ベクターをすでに作成済みであるが、Arkadiaベクター大量培養を次年度に行う予定である。大量培養が次年度にずれこんだため大量培養にかかる経費が次年度に生じた。また、マウス作成解析にかかる経費も次年度にずれ込んだ。
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| 次年度使用額の使用計画 |
培養細胞のおける解析のために必要なArkadiaレンチウイルスベクターはすでに構築済みであるが、現在増殖中であり増殖に経費がかかる予定である。また、マウスの交配にともない解析に経費がかかる予定である。
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