膵ランゲルハンス島移植時の適切な移植部位が探索できるクローンブタの作出とその応用

2013 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 25293279
• 研究種目: 基盤研究(B)
• 研究機関: 明治大学
• 研究代表者: 長屋 昌樹 明治大学, 公私立大学の部局等, 教授 (90329300)
• 研究分担者: 長嶋 比呂志 明治大学, 農学部, 教授 (50318664) ; 梅山 一大 明治大学, 公私立大学の部局等, 准教授 (70342699) ; 渡辺 將人 明治大学, 公私立大学の部局等, 講師 (00321688) ; 新井 良和 明治大学, 公私立大学の部局等, 研究員 (90614769) ; 松成 ひとみ 明治大学, 公私立大学の部局等, 研究員 (70639517)
• 研究期間 (年度): 2013-04-01 – 2016-03-31
• キーワード: 膵島移植 / 膵ランゲルハンス島 / 糖尿病 / クローンブタ / 拒絶 / ヒト糖尿病モデルモデル / 赤紫蛍光蛋白Plum

研究概要

1型糖尿病患者には、生活の質を改善させるべく膵ランゲルハンス島 (以下、膵島)移植療法が行われている。膵島移植を受けた患者数は2005年まで増加したが、この年を境に漸減した。膵島移植の患者数の漸減の理由の一つに膵島の絶対的な生着率の低さがあり、これは深刻な問題となっている。生着率の低さをもたらす問題には1．instant blood mediated inflammatory reaction、2．膵島に供給される酸素不足、3．膵島が高血糖にさらされる、など、いくつもの原因が挙がってきている。新たに適切な移植先、方法を見出さない限り、移植された膵島の絶対的な生着率の低さという大きな問題は克服できない。本研究では、ドナーの膵島がレシピエント体内で拒絶を受けない仕組みとなる2種類のクローンブタモデルを作出し、膵島移植時の適切な移植部位の探索を目的としている。膵島移植における適切な移植部位を探索する場合、レシピエント体内で生存し続ける膵島を追跡する必要があるため、膵島が蛍光蛋白マーカーを保有すれば、移植後の細胞の追跡は長期でも容易となる。一方、緑色蛍光蛋白 (GFP)に代表される蛍光蛋白には抗原性があり、抗原性に起因する拒絶反応が移植細胞へ影響を及ぼし、長期の追跡を不可能にさせる。蛍光蛋白＋個体と、その変異体である非蛍光化変異型蛋白＋個体の2種類を体細胞クローン技術で作出すれば、蛍光蛋白＋ブタのドナー膵島が非蛍光蛋白＋のレシピエントとなる糖尿病ブタに移植されても、レシピエントブタの体内でドナー膵島は免疫寛容となり、免疫拒絶を受けることはない。平成25年度達成の目標は、膵島移植における適切な移植部位を探索するために赤紫蛍光蛋白Plumまたは非蛍光化変異型蛋白Plumを発現する2種類のクローンブタを作出することであった。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

平成25年度達成の目標は、膵島移植における適切な移植部位を探索するために赤紫蛍光蛋白Plumまたは非蛍光化変異型蛋白Plumを発現する2種類のクローンブタを作出することであった。赤紫蛍光蛋白Plumを全身に発現するブタの作出に成功、または非蛍光化変異型蛋白Plumを発現する胎児は得たものの死産となったため、新たに作出の試みを終えた。妊娠診断でも非蛍光化変異型蛋白Plumブタの胎児は確認できている。

今後の研究の推進方策

平成26年度達成目標は、1．平成25年度の赤紫蛍光蛋白Plumまたは非蛍光化変異型蛋白Plumを発現する2種類のクローンブタを作出することを継続し、移植に十分な数の両個体の確保、2．非蛍光化変異型蛋白Plum＋の糖尿病ブタの様々な場所に移植された蛍光蛋白Plum＋のブタ膵島を回収し、分子生物学的手法にて膵島の変化を定量的に解析し、適切な移植部位を検討することである。一方で本年度の目標の達成には、赤紫蛍光蛋白Plumまたは非蛍光化変異型蛋白Plumを発現する2種類のクローンブタを安定的に作出することが重要となる。

次年度の研究費の使用計画

膵島移植における適切な移植部位を探索するために赤紫蛍光蛋白Plumまたは非蛍光化変異型蛋白Plumを発現する2種類のクローンブタを作出することであった。平成25年度中には、赤紫蛍光蛋白Plumを全身に発現するブタの作出に成功したものの、非蛍光化変異型蛋白Plumを発現する胎児は得たが死産となった。次年度使用額が生じた理由は1．非蛍光化変異型蛋白Plumブタの飼育、2．赤紫蛍光蛋白Plumブタ、非蛍光化変異型蛋白Plumブタ間の移植、に予定していた費用が非蛍光化変異型蛋白Plumの死産のために押さえられたからである。
非蛍光化変異型蛋白Plumブタの作出が安定することにより、平成25年度の持ち越し額は使用されることとなる。平成26年度は赤紫蛍光蛋白Plumまたは非蛍光化変異型蛋白Plumを発現する2種類のクローンブタの移植に十分な数の両個体の確保、引き続き、非蛍光化変異型蛋白Plum＋の糖尿病ブタの様々な場所に移植された蛍光蛋白Plum＋のブタ膵島を回収し、分子生物学的手法にて膵島の変化を定量的に解析し、適切な移植部位を検討する。

研究成果

• [雑誌論文] Transgenic pigs with pancreas specific expression of green fluorescent protein. (2014)
  • 著者名/発表者名: Matsunari H, Kobayashi T., Watanabe M, Umeyama K, Nakano K, Kanai T, Matsuda T, Nagaya M, Hara M, Nakauchi H, Nagashima H
  • 雑誌名: J Reprod Dev 巻: [Epub ahead of print] ページ: /
  • 査読あり
• [雑誌論文] Generation of interleukin-2 receptor gamma gene knockout pigs from somatic cells genetically modified by zinc finger nuclease-encoding mRNA.. (2013)
  • 著者名/発表者名: Watanabe M, Nakano K, Matsunari H, Matsuda T, Maehara M, Kanai T, Kobayashi M, Matsumura Y, Sakai R, Kuramoto M, Hayashida G, Asano Y, Takayanagi S, Arai Y, Umeyama K, Nagaya M, Hanazono Y, Nagashima H
  • 雑誌名: PLOS ONE 巻: 8 ページ: e76478
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0076478. eCollection 2013.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Production of diabetic offspring using cryopreserved epididymal sperm by in vitro fertilization and intrafallopian insemination techniques in transgenic pigs. (2013)
  • 著者名/発表者名: Umeyama K, Honda K, Matsunari H, Nakano K, Hidaka T, Sekiguchi K, Mochizuki H, Takeuchi Y, Fujiwara T, Watanabe M, Nagaya M, Nagashima H.
  • 雑誌名: J Reprod Dev. 巻: 59 ページ: 599-603.
  • 査読あり
• [学会発表] 膵臓欠損ブタ胎仔を用いた外来性細胞由来膵臓形成の試み. (2014)
  • 著者名/発表者名: 松成ひとみ、浅野吉則、小林美里奈、内倉鮎子、渡邊將人、梅山一大、長屋昌樹、中内啓光、長嶋比呂志.
  • 学会等名: 第13回日本再生医療学会総会.
  • 発表場所: 京都.
  • 年月日: 20140304-20140306
• [学会発表] In vivo exogenic organ generation with organogenesis-disabled cloned pigs as a platform. (2014)
  • 著者名/発表者名: Matsunari H, Nakano K, Kanai T, Matsuda T, Maehara M, Watanabe M, Umeyama K, Nagaya M, Nakauchi H, Nagashima H
  • 学会等名: 40th Annual Conference of the International Embryo Transfer Society
  • 発表場所: Reno, USA.
  • 年月日: 20140111-20140114
• [学会発表] Generation and characterization of transgenic-cloned pigs expressing the far-red fluorescent protein monomeric plum. (2014)
  • 著者名/発表者名: Kobayashi M, Watanabe M, Matsunari H, Nakano K, Kanai T, Hayashida G, Matsumura Y, Kuramoto M, Sakai R, Arai Y, Umeyama K, Watanabe N, Onodera M, Nagaya M, Nagashima H.
  • 学会等名: 40th Annual Conference of the International Embryo Transfer Society
  • 発表場所: Reno, USA.
  • 年月日: 20140111-20140114
• [学会発表] ブタ卵におけるmRNA injection法を用いたZinc Finger Nucleasesによる遺伝子ノックアウト. (2013)
  • 著者名/発表者名: 松田泰輔, 渡邊將人, 中野和明, 松成ひとみ, 小林美里奈, 林田豪太, 倉本桃子, 金井貴博, 山口智之, 中内啓光, 長屋昌樹, 長嶋比呂志.
  • 学会等名: 第36回日本分子生物学会.
  • 発表場所: 神戸.
  • 年月日: 20131203-20131206
• [学会発表] Zinc finger nuclease発現mRNAによるIL2RG遺伝子ノックアウトブタの作出. (2013)
  • 著者名/発表者名: 渡邊將人, 中野和明, 松成ひとみ, 松田泰輔, 金井貴博, 小林美里奈, 松村幸奈, 坂井理恵子, 倉本桃子, 林田豪太, 浅野吉則, 高柳就子, 新井良和, 梅山一大, 長屋昌樹, 豊 花, 長嶋比呂志
  • 学会等名: 第36回日本分子生物学会.
  • 発表場所: 神戸.
  • 年月日: 20131203-20131206
• [学会発表] 異種移植研究における遺伝子改変ブタの作出への人工生殖技術の利用. (2013)
  • 著者名/発表者名: 坂井理恵子, 中野和明, 松成ひとみ, 新井良和, 渡邊將人, 梅山一大, 佐原寿史, 山田和彦, 長屋昌樹, 宮川周士, 長嶋比呂志.
  • 学会等名: 第1回日本先進医工学ブタ研究会.
  • 発表場所: 大阪.
  • 年月日: 20131112-20131112
• [学会発表] 細胞周期可視化蛍光プローブFucci を発現するブタ体細胞核移植胚の作出. (2013)
  • 著者名/発表者名: 林田豪太, 渡邊将人, 松成ひとみ, 中野和明, 金井貴博, 小林美里奈, 松村幸奈, 倉本桃子, 坂井理恵子, 浅野吉則, 内倉鮎子, 前原美樹, 新井良和, 梅山一大, 長屋昌樹, 沢野朝子, 宮脇敦史, 長嶋比呂志.
  • 学会等名: 第106回日本繁殖生物学会大会.
  • 発表場所: 東京.
  • 年月日: 20131111-20131114
• [学会発表] ガラス化保存された体外成熟／体外受精胚を用いた糖尿病モデル遺伝子改変ブタの作出. (2013)
  • 著者名/発表者名: 松村幸奈, 前原美樹, 本田香澄, 林田豪太, 倉本桃子, 中野和明, 松成ひとみ, 小林美里奈, 内倉鮎子, 浅野吉則, 渡邊将人, 梅山一大, 長屋昌樹, 長嶋比呂志.
  • 学会等名: 第106回日本繁殖生物学会大会.
  • 発表場所: 東京.
  • 年月日: 20131111-20131114
• [学会発表] Application of blastocyst complementation to development of genetically modified pigs for xenotransplantation. (2013)
  • 著者名/発表者名: Nakano K, Matsunari H, Matsuda T, Kanai T, Hayashida G, Matsumura K, Kobayashi M, Kuramoto M, Asano Y, Sakai R, Uchikura A, Arai Y, Watanabe M, Umeyama K, Nagaya M, Nagashima H.
  • 学会等名: 12th Congress of International Xenotransplantation Association (IXA).
  • 発表場所: Osaka, Japan.
  • 年月日: 20131110-20131113
• [学会発表] In vivo generation of exogenic pancreas in apancreatic cloned pigs via blastocyst complementation. (2013)
  • 著者名/発表者名: Matsunari H, Nakano K, Kanai T, Matsuda T, Maehara M, Watanabe M, Umeyama K, Nagaya M, Nakauchi H, Nagashima H.
  • 学会等名: 12th Congress of International Xenotransplantation Association (IXA).
  • 発表場所: Osaka, Japan.
  • 年月日: 20131110-20131113
• [学会発表] 遺伝子改変クローンブタ開発における人工生殖技術を利用した遺伝的バックグラウンドの更新. (2013)
  • 著者名/発表者名: 坂井理恵子, 中野和明, 松成ひとみ, 新井良和, 渡邊將人, 梅山一大, 長屋昌樹, 宮川周士, 長嶋比呂志.
  • 学会等名: 第16回日本異種移植研究会.
  • 発表場所: 大阪.
  • 年月日: 20131110-20131110
• [備考] 明治大学バイオリソース研究国際インスティチュート
  • URL: http://muiibr.com/