| 研究課題/領域番号 |
25293321
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
藤田 香里 京都大学, iPS細胞研究所, 研究員 (10633092)
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| 研究分担者 |
妻木 範行 京都大学, iPS細胞研究所, 教授 (50303938)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | 細胞老化 / 間葉系幹細胞 / 軟骨細胞 / 分化誘導 / p53 / p53 isoforms |
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| 研究概要 |
まず実験を開始するに当たり、研究用ヒト間葉系幹細胞を用いるため、京都大学３部合同倫理委員会への申請とヒト遺伝子解析実験の申請を行い、それぞれ承認を受けた。また、用いるヒト間葉系幹細胞のいくつかは、理化学研究所Cell Bankより供与を希望していたので、理化学研究所とのMTAの締結を行い、細胞を入手した。さらに、p53 isoformとp53のコンストラクト等の使用に関して、米国国立癌研究所とのMTA締結を行った。
理研Cell Bankより入手した若年期、老年期それぞれの細胞提供者由来の間葉系幹細胞４種類（若年期２種類、老年期２種類）について、donor ageと細胞老化、p53、p53 isoformの発現プロファイルを解析するために培養を介さず細胞を保存した。また、一部は培養過程で生ずる細胞老化との関連性を見るため、７ヶ月間 lifespan assay を行い、各time point 毎に細胞を回収している。また、市販の研究用ヒト間葉系幹細胞２株（２株とも若年期細胞提供者からのもの）を入手、培養過程で生ずる細胞老化がヒト間葉系幹細胞でも観察されるか、p53 isoformsの発現プロファイルは見られるかを目的に、lifespan assayを行い、各time point 毎に細胞を回収している。
さらにヒト正常線維芽細胞で見られた細胞増殖、細胞老化関連の現象が認められるかを目的に、full-length p53、p53 isoforms (p53 beta、delta133p53)をヒト間葉系幹細胞に導入した。Delta133p53については、仮説どおりに細胞増殖の亢進が認められ、細胞老化への影響を現在解析中である。Full-length p53、p53 betaの過剰発現は、ヒト正常線維芽細胞での効果と異なる可能性が出てきており、これを詳細に解析する予定である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
実験を行うに当たっての様々な申請と承認を受けるのに予定より時間がかかったためと考えている。
しかし、実験開始後は順調に実験が進んでいると思われる。
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| 今後の研究の推進方策 |
現在までに回収している細胞ペレットを用いて、p53、p53 isoforms発現プロファイル、老化関連分子発現の解析を行う。さらに、細胞老化（donor age、培養過程で生じたもの）を起こした間葉系幹細胞から軟骨細胞に分化誘導させ、細胞老化を起こしていない場合とどのような違いが生ずるかを軟骨細胞分化マーカーの発現を中心に解析する。また、これらとp53 isoformsの過剰発現と軟骨細胞への分化誘導についても解析し、donor age、培養過程で生じた細胞老化による影響とp53 isoformsによる細胞老化の影響を比較検討する。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
当初H25年度に行う予定だった実験の多くが、間葉系幹細胞の取り扱い等の申請、マテリアルのMTA締結に時間がかかり、行えなかったことが理由である。
RNA-SeqやChIP-Seqなどの外注、分化実験に伴う高価な培地やリコンビナントタンパク質の購入に使用予定である。
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