| 研究課題/領域番号 |
25293345
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| 研究機関 | 慶應義塾大学 |
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研究代表者 |
浜谷 敏生 慶應義塾大学, 医学部, 講師 (60265882)
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| 研究分担者 |
阿久津 英憲 独立行政法人国立成育医療研究センター, その他部局等, その他 (50347225)
秦 健一郎 独立行政法人国立成育医療研究センター, その他部局等, その他 (60360335)
津村 秀樹 独立行政法人国立成育医療研究センター, その他部局等, その他 (20180052)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | 着床前期胚 / SCAN / ZGA / 発現プロファイリング / 新規遺伝子 / 染色体ギャップ / ゲノム不安定性 / MEP50 |
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| 研究実績の概要 |
本研究では、着床前期胚発生における胚性ゲノムの活性化(ZGA)や分化全能性の獲得などに係る分子機構の解明を目指した。着床前期で特異的に発現している新規遺伝子Zfpi および Kzpiに着目し、初期胚発生及びES細胞における役割を明らかにすることを目的とした。ZfpiはSCNA-zinc fingerタンパクをコードする。ノックアウト(KO)マウスは成獣まで発生し、生殖能も維持されていた。着床前期胚発生や産仔数にも異常は認められず、KOマウスの胚盤胞からES細胞(KO ES)を樹立することも可能で、KO ES細胞は未分化性、多分化能性にも異常を認めなかった。しかし、核型解析を行ったところ、KO ES細胞のみならず、KOマウス（脾リンパ球）でも高頻度にchromosomal gapが認められた。 KO ES細胞と野生型ES細胞の遺伝子発現を網羅的に比較検討したところ、有意に発現レベルの異なる遺伝子が抽出された(887 transcripts)。一方、Zfpiを過剰発現するES細胞を作成したが、野生型ES細胞に比べ表現型に変化は認められなかった。Zfpi過剰発現ES細胞で発現するタンパクからZfpiと結合するものを探索するため、免疫沈降、2次元タンパク泳動、LC-MSにより、MEP50がZFPIと結合していると考えられた。MEP50は、PRMT5とも結合し、ヒストンH2A/H4のメチル化に重要な役割を果たす。以上のように、KOマウスの表現型に異常は認められなかったが、体細胞の染色体に構造異常(凝縮不全の疑い)をもつことや、ZFPIがMEP50と結合することから、Zfpiはゲノムや染色体の安定性に寄与している可能性が示唆された。
一方、卵細胞および着床前期胚でテロメア長を解析する技術を安定させるため、テロメアqPCR、定量的FISHを用いて、新鮮卵と加齢卵のテロメア長の測定を試みた。その結果、母体加齢により卵のテロメア長が短縮することが明らかとなった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
ノックアウトマウスの表現型が安定しない。網羅的ゲノムDNAメチル化解析を進めるには、サンプルが稀少であるため、解析結果が安定しない。そこで、Kzpiについては、キメラの親から生まれたヘテロマウスの凍結卵を融解して、再度交配を始めた。ホモマウスを作成し、継代観察するとともに、解析に十分なサンプル量を得る予定である。
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| 今後の研究の推進方策 |
いずれの遺伝子についても、ノックアウトマウスの表現型と遺伝子機能を十分結びつけることができていないため、さらに遺伝子機能の解析を進める。
Zfpiについては、染色体不安定性を惹起する分子機構の解明を目指す。まずは、ZfpiノックアウトES細胞について紫外線照射後培養やマイトマイシン添加培養を行う。
Kzpiについては、前述の通り新たに得られるノックアウトマウスの生殖細胞と初期胚におけるDMRのメチル化レベルの解析、新たに樹立するノックアウトES細胞におけるKZPIと結合するDNA配列やタンパクを明らかにする。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
研究を予定とおりに進めることができず、やや遅延しているため。
研究遅延の理由は以下に因る。
ノックアウトマウスの表現型が安定しない。継代を重ねると表現型が減弱する傾向を認めている。また、網羅的ゲノムDNAメチル化解析を進めるには、サンプルが稀少であるため、解析結果が安定しない。
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| 次年度使用額の使用計画 |
Kzpiについては、キメラの親から生まれたヘテロマウスの凍結卵を融解して、再度交配を始めた。ホモマウスを作成し、継代観察するとともに、解析に十分なサンプル量を得る予定である。そのため今年度は昨年度に予定していた解析も含めて完了したいと考えている。
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