| 研究課題/領域番号 |
25293363
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 研究機関 | 慶應義塾大学 |
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研究代表者 |
貴志 和生 慶應義塾大学, 医学部, 教授 (40224919)
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| 研究分担者 |
久保田 義顕 慶應義塾大学, 医学部, 准教授 (50348687)
林 瑠加 慶應義塾大学, 医学部, 助教 (50445392)
荒牧 典子 慶應義塾大学, 医学部, 講師 (80365311)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | 皮膚 / 再生 / 胎仔 |
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| 研究概要 |
胎生13日創傷部の辺縁と正常部位の表皮、胎生14日創傷部辺縁と正常部位の表皮の4点を比較することで得られた、胎生13日創傷部位でのみ発現している遺伝子、または胎生14日の創傷部でのみ発現している遺伝子の発現が正しいか否かを、real time PCRにより確認した。ICRマウス胎生13日と14日の胎仔に胎仔手術を施し、側胸部に長軸方向に長さ約２ｍｍの、皮膚肉様筋に至る皮膚全層切開創を作成した。創作成後15時間に動物を安楽死させ、体幹部を創を含めて輪切りにしたのち組織をRNAlater（Quiagen社）に浸漬し、その後OCTコンパウンドに包埋し、急速冷凍し-80℃で保存した。清潔にしたクライオスタットで、凍結標本から厚さ10μmの凍結切片を約50個作成し、RNAse freeのスライドグラスで組織切片を回収する。直後にレーザーマイクロダイセクションシステムPALM MicroBeam（カールツァイスマイクロイメージング社）を用いて、創辺縁部の表皮、真皮、反対側正常体幹部の表皮、真皮を別々にモニター上で切り出し、光ピンセットを用いて回収し、total RNAを回収した。胎生14日に作成した創傷に関しても同様の処置を行った。
このようにして回収した表皮4検体、真皮4検体のＲＮＡを増幅させた後、reverse transcriptaseを用いてcDNAに変換した。
また、平成26年度の研究で必要な、in situ hybridizationの技術を習得した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究の最も大切な部分であるレーザーマイクロダイセクションを用いた組織の切り出しと、そこからのRNAの抽出が順調に行われている。
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| 今後の研究の推進方策 |
胎生13日創傷部の辺縁と正常部位の表皮、胎生14日創傷部辺縁と正常部位の表皮の4点を比較することで得られた、胎生13日創傷部位でのみ発現している遺伝子、または胎生14日の創傷部でのみ発現している遺伝子の発現が正しいか否かを、real time PCRにより確認する。上記と同様に、胎仔手術施し、様々な時間ののちに創傷部を含めた組織を採取し、RNAを採取、発現とその変化を定量的に調べる。また、同様に４％パラフォルムアルデヒドで固定したサンプルから、パラフィン切片を作成し、in situ hybridizationで発現の局在と、確かに表皮細胞で発現しているか否かを確認する。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
RNA回収後に、マイクロアレイによる解析を行う前に、RNAの増幅の作業が必要となった。このため、マイクロアレイは未購入であるため。
マイクロアレイの購入に充当する。
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