| 研究課題/領域番号 |
25293365
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 研究機関 | 名古屋大学 |
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研究代表者 |
松田 直之 名古屋大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (50332466)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | 敗血症 / 多臓器不全 / 播種性血管内凝固症候群 / 遺伝子治療 / 再生治療 / iPS細胞 / 肺線維化 |
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| 研究概要 |
本研究は，敗血症病態で誘導される多能性分化細胞の機能を解析することを目的として，平成25年度に施行された。 盲腸結紮穿孔による敗血症モデルマウスの時系列で，心臓血1 mLを採取し，抗サイトケラチン抗体を接合させたビーズを用いて骨髄由来多能性分化細胞を分離した。このtotal RNAを抽出して，現在，サイトケラチン陽性の幼若球の遺伝子発現を解析中である。RT-PCR法では，Oct3/4, Sox2, Klf4, c-MycなどのmRNA発現の変化を認めている。
また，本研究は敗血症病態における線維芽細胞を多能性分化細胞にリセットすることを目的として，平成25年度は線維芽細胞の細胞表面の受容体発現と，機能の解析を施行した。この過程で，ヒト繊維芽細胞にはprotease activated receptorの高い発現を認め，トロンビン刺激で線維芽細胞が増殖する傾向を示すことを確認した。一方で，ヒト線維芽細胞にセンダイウイルスベクターを用いてOct3/4, Sox2, Klf4, c-Mycの4つを遺伝子導入した系において，トロンビン刺激がどのように作用するかを評価している過程である。敗血症病態では，改善期に様々な臓器で線維芽細胞が増殖し，線維化が臓器傷害として残存することがある。この機序を抑制する目的として，現在，ヒト線維芽細胞のリプログラミングをiPS細胞の応用として施行しようとしている。
以上の研究を平成26年度においても継続し，さらに本研究を敗血症マウスの肺線維化の治療として発展させる予定である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
ヒト線維芽細胞にセンダイウイルスベクターを用いてOct3/4, Sox2, Klf4, c-Mycの4つを遺伝子導入し，機能再生に役立てるための本年度の研究基盤として，順調に研究が進行している。
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| 今後の研究の推進方策 |
敗血症の時系列で，経気管投与と静脈内投与の2つの経路で，センダイウイルスベクターやリポゾーム法を用いてOct3/4, Sox2, Klf4, c-Mycなどの転写因子を肺などの主要臓器に導入し，主要臓器の組織学的変化を解析する。この研究では，平成25年度の段階で評価予定である48時間レベルで死亡する「急性炎症敗血症モデル」と，敗血症から回復する過程で臓器傷害が観察される「臓器傷害モデル」の2つを用いる。
主な評価組織は，肺，心筋，肝臓，腎臓，脾臓，腸管，膵臓，副腎，脳および大動脈であり，組織基本評価として，ヘマトキシリン・エオジン染色像，および線維化組織の評価としてのシリウスレッド染色を行う。さらに，共焦点レーザー顕微鏡による多重免疫染色により，in vivoにおけるiPS細胞や間質系多能性分化細胞の分子局在をより明確なものとする。すなわち，各組織の凍結切片，あるいはパラフィン切片を用い，線維芽細胞染色（抗 Fibroblast Surface Protein 抗体，抗 S100A4 抗体，抗 Prolyl-4-Hydroxylase β 抗体などの線維芽細胞特異抗体を用いた組織染色），核染色（ヘキスト染色），組織間質染色（抗ビメンチン抗体染色），血管内皮細胞染色（抗von Willebrand factor抗体染色など），さらに透過像を加え，この5重像に対して，iPS細胞として抗Sox2抗体など，間葉系細胞として抗サイトケラチン抗体染色などを付加し，各臓器におけるiPS細胞や間葉系細胞の分布と組織構造変化を評価する。特に，血管内皮細胞の再生については，透過型電子顕微鏡像による評価を加え，さらに研究3によりiPS細胞に特異性を示すと評価されたマーカー分子の抗体を用いて，血管内皮細胞に分化するiPS細胞様の細胞環境を免疫組織電子顕微鏡像として評価したい。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
ゲルや抗体などの研究に必要とする消耗品の納品が遅れた。また，現在も適切なRNAを敗血症マウスより回収している状況にあり，最終的に遺伝子の網羅解析に用いる費用を残している。
ゲルや抗体などの研究に必要とする消耗品を納品後に使用する。また，サイトケラチン抗体ビーズ法で回収した敗血症マウス血中の幼若細胞におけるRNAサンプルが完全にそろった段階で，それらに発現しているRNAの網羅解析を行う。
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