RANKL結合ペプチドのオリゴマー化による新規骨形成促進剤の創生

2014 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 25293377
• 研究機関: 東京医科歯科大学
• 研究代表者: 青木 和広 東京医科歯科大学, 医歯(薬)学総合研究科, 准教授 (40272603)
• 研究分担者: 本間 雅 東京大学, 医学部附属病院, 准教授 (60401072)
• 研究期間 (年度): 2013-04-01 – 2016-03-31
• キーワード: 骨形成促進剤 / ペプチド創薬 / 骨芽細胞 / RANKL親和性 / 骨形態計測

研究実績の概要

我々は骨芽細胞膜上のRANKL(receptor activator of NF-kB ligand) はリガンドとしてではなく、骨芽細胞内にシグナル（逆シグナル）を通す受容体としても働いていると仮定して仕事を進めてきた。すでに、研究分担者の本間雅先生のグループでは2009年から骨芽細胞あるいは骨細胞でRANKL逆シグナルの存在を示す報告を行っている。
この一連の発表ではRANK刺激によりRANKLを含んだ小胞体の膜輸送が促進すると報告しているが、本研究によりRANKL結合ペプチドによる骨形成活性促進作用もこの逆シグナルを通すことを見出した。このことは、RANKLが骨形成促進作用を持つ新規薬物開発のターゲット分子になることを示唆している。大阪大学薬学部との共同研究により、RANKLに結合するペプチドのスクリーニングをファージディスプレー法によりすすめた結果、すでに骨形成促進作用を報告しているRANKL結合ペプチドW9のシークエンスを組み込んだファージよりもRANKL親和性の高いファージがいくつか見つかってきた。
W9ペプチドとは別のRANKL結合ペプチドXの骨形成促進能はW9ペプチドより強いことが分かっていたが、この骨形成促進作用の違いを逆シグナルの強弱により説明できるか否かを確かめるために、骨芽細胞株ST-2を用いてW9ペプチドとペプチドXそれぞれの刺激による逆シグナルの強さを比較したところ、ペプチドXの方がW9よりも逆シグナル強度が強いことがシグナル分子のリン酸化レベルの強さの差として示され、ペプチドXとW9との骨形成促進能差が逆シグナルの強度の差としても説明できることが示唆された。
ペプチドXの骨形成促進能をリウマチ関節モデルで試したところ、膝関節部の骨端部や2次海綿骨部において、骨吸収抑制作用とともに骨形成促進作用を発揮することが骨形態計測法により明らかとなった。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

25年度はリポゾーム化したペプチドの骨形成促進作用が明らかではなかったが、26年度はRANKLに結合するペプチドXの作用が明らかになるとともに、in vivoモデルでも骨形成促進作用が明らかになり、RANKLを新たな骨形成のターゲットとするための研究目的が一歩前進したため。共同研究として進めているファージディスプレー法によるRANKL結合ペプチドのスクリーニングだが、27年度に期待できる成果が上がっていることも理由の一つである。

今後の研究の推進方策

27年度はRANKLに結合するペプチドXを用いて、すでに昨年度良い成果が上がっている関節リウマチモデルを用いた解析だけでなく、歯科領域の関連モデルを用いてペプチドXの骨形成促進作用を明らかにする予定である。新たに用いるモデルとして、切歯を抜歯した後の骨新生を解析する切歯抜歯窩モデルと上顎粘膜下の骨が欲しい場所に担体とともにペプチドを注射で打ち込む上顎骨骨新生モデルを用いる。ペプチドXだけでは期待した骨新生が認められない場合はBMP-2との併用も検討する。
25年度から取り組んでいるペプチドのリポゾーム化による骨形成促進作用を増強する試みも進め、リポゾーム周囲のPEGに反応させるペプチドXの割合を2％から5％に増やすことにより骨形成促進能が向上するか否かをRANKL逆シグナル指標の解析と頭蓋骨骨欠損モデルの解析により明らかにする。
共同研究を進めているファージディスプレイ法によるRANKL結合ペプチドのスクリーニングは、すでに釣れてきているRANKL結合ファージの中から、RANKL親和性の高いファージを選び、ペプチド合成を委託する。ペプチド合成後に表面プラズマ共鳴装置を用いてRANKL親和性を測定し、ファージディスプレイ法で示した親和性が再現できるか確認する。RANKL親和性が確認できた後に、RANKL逆シグナルの検討、および骨芽細胞分化促進作用の検討をすでにRANKL逆シグナルを入れ骨形成促進作用が明らかなRANKL結合ペプチドであるW9ペプチドを対照として比較する。その後、W9ペプチドに比べて骨形成促進作用が強いと示唆される新規RANKLペプチドを選び、頭蓋骨骨欠損モデルを用いてin vivoの骨形成促進作用を検討する。さらに、スクリーニングして得られた新規RANKL結合ペプチドもリポゾーム化し上記と同様なin vitroとin vivoの解析を加える。

次年度使用額が生じた理由

事務手続きの関係上、次年度の使用額として計上することになった

次年度使用額の使用計画

事務手続き上のことであり、すぐに使用したいペプチドの合成費用など、消耗品費として使用する

備考

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研究成果

• [雑誌論文] Effective expansion of engrafted human hematopoietic stem cells in bone marrow of mice expressing human Jagged1aDepartment of Immunology. (2014)
  • 著者名/発表者名: Negishi, N. Suzuki, D. Ito, R. Irie, N. Matsuo, K. Yahata, T. Nagano, K. Aoki, K. Ohya, K. Hozumi, K. Ando, K. Tamaoki, N. Ito, M. Habu, S.
  • 雑誌名: Experimental Hematology 巻: 42 ページ: 487-494
• [雑誌論文] Inhibition of BMP2-induced bone formation by the p65 subunit of NF-kB via an interactionwith Smad4. (2014)
  • 著者名/発表者名: Hirata-Tsuchiya, S. Fukushima, H. Katagiri, T. Ohte, S. Shin, M. Nagano, K. Aoki, K. Morotomi, T. Sugiyama, G. Nakatomi, C. Kokabu, S. Doi, T. Takeuchi, H. Ohya, K. Terashita, M. Hirata, M. Kitamura, C. Jimi, E
  • 雑誌名: Mol Endocrinol 巻: 28(9) ページ: 1460-1470
  • DOI: 10.1210/me.2014-1094
• [雑誌論文] A disulfide bond replacement strategy enables the efficient design of artificial therapeutic peptides. (2014)
  • 著者名/発表者名: Aoki, K. Maeda, M. Nakae, T. Okada, Y. Ohya, K. Chiba, K
  • 雑誌名: Tetrahedron 巻: 70 ページ: 7774-7779
  • DOI: 10.1016/j.tet.2014.05.079
• [雑誌論文] NF-κB RELA-deficient bone marrow macrophages fail to support bone formation and to maintain the hematopoietic niche after lethal irradiation and stem cell transplantation. (2014)
  • 著者名/発表者名: Mise-Omata, S. Neil Alles, N. Fukazawa, T. Aoki, K. Ohya, K. Jimi, E. Obata, Y. Doi, T
  • 雑誌名: International Immunology 巻: 26(11) ページ: 607-618
  • DOI: 10.1093/intimm/dxu062
• [雑誌論文] Gelatin hydrogel as a carrier of recombinant human fibroblast growth factor-2 during rat mandibular distraction. (2014)
  • 著者名/発表者名: Kimura A, Kabasawa Y, Tabata Y, Aoki K, Ohya K, Omura K
  • 雑誌名: J Oral Maxillofac Surg 巻: 72(10) ページ: 2015-2031
  • DOI: 10.1016/j.joms.2014.03.014. Epub
• [学会発表] 骨再生ペプチドの網羅的改変による親和性向上とその特性評価 (2015)
  • 著者名/発表者名: 永野貴士、向 洋平、菅森泰隆、加藤玄樹、青木和広、長野一也、鎌田春彦、角田慎一、東阪和馬、吉岡靖雄、堤 康央
  • 学会等名: 日本薬学会第135回年会
  • 発表場所: 神戸市
  • 年月日: 2015-03-25 – 2015-03-28
• [学会発表] 骨再生ペプチドの医薬品化を目的とした新規高親和性骨再生ペプチドの創製に向けた基礎検討. (2014)
  • 著者名/発表者名: 永野貴士、向 洋平、菅森泰隆、加藤玄樹、青木和広、大谷啓一、東阪和馬、吉岡靖雄、長野一也、鎌田春彦、角田慎一、堤 康央.
  • 学会等名: 第87回日本生化学会大会
  • 発表場所: 国立京都国際会館（京都市）
  • 年月日: 2014-10-15 – 2014-10-17
• [学会発表] RANKL結合ペプチドの骨吸収抑制作用と骨形成促進作用. (2014)
  • 著者名/発表者名: 青木和広、菅森泰隆、加藤玄樹、上原智己、新井祐貴、Md.Zahirul Haq Bhuyan、Neil Alles、Masud Khan、高橋真理子、田村幸彦、若林則幸、大谷啓一.
  • 学会等名: 第56回歯科基礎医学会学術大会・総会
  • 発表場所: 福岡国際会議場（福岡市）
  • 年月日: 2014-09-25 – 2014-09-27
• [学会発表] Ⅱ型ウシコラーゲン誘導のマウス関節リウマチモデルを用いたRANKL結合ペプチドの骨形成促進作用と骨吸収抑制作用. (2014)
  • 著者名/発表者名: 加藤玄樹、清水康広、菅森泰隆、田村幸彦、小野卓史、大谷啓一、青木和広.
  • 学会等名: 第56回歯科基礎医学会学術大会・総会
  • 発表場所: 福岡国際会議場（福岡市）
  • 年月日: 2014-09-25 – 2014-09-27
• [学会発表] RANKL-binding peptides increased bone formation in a murine calvarial defect model. (2014)
  • 著者名/発表者名: Y, Sugamori. M, Honma. G, Kato. Y, Tamura. Y, Furuya. H, Yasuda. Y, Tabata. N, Udagawa. K, Ohya. H, Suzuki. K, Aoki.
  • 学会等名: アメリカ骨代謝学会2014
  • 発表場所: テキサス州ヒューストン市(USA)
  • 年月日: 2014-09-12 – 2014-09-15
• [学会発表] RANKL結合ペプチドはマウス頭蓋骨欠損モデルの骨新生を促進する． (2014)
  • 著者名/発表者名: 菅森泰隆、本間雅、加藤玄樹、田村幸彦、古屋優里子、保田尚孝、田畑泰彦、宇田川信之、大谷啓一、鈴木洋史、青木和広
  • 学会等名: 第32回日本骨代謝学会学術集会
  • 発表場所: 大阪国際会議場（大阪市）
  • 年月日: 2014-07-24 – 2014-07-26
• [学会発表] Basic analysis for screening a novel bone-regenerating peptide from the phage peptide library. (2014)
  • 著者名/発表者名: Nagano, T. Mukai, Y. Sugamori, Y. Kato, G. Ohya, K. Aoki, K. Higashisaka, K. Yasuo Yoshioka, Y. Nagano, K. Kamada, H. Tsunoda, S. Tsutsumi, Y.
  • 学会等名: CRS2014
  • 発表場所: シカゴ市(USA)
  • 年月日: 2014-07-12 – 2014-07-16
• [学会発表] マウス骨吸収モデルにおいてPEG架橋したCHPナノゲルは合成ペプチドW9の骨量減少抑制効果を増強した (2014)
  • 著者名/発表者名: 佐藤俊三、青木和広、田村幸彦、大谷啓一
  • 学会等名: 第34回日本歯科薬物療法学会学術大会
  • 発表場所: 大阪歯科大学創立100周年記念館（大阪市）
  • 年月日: 2014-06-21 – 2014-06-22
• [備考] 硬組織薬理学分野ホームページ
  • URL: http://www.tmd.ac.jp/hpha/
• [産業財産権] オステオプロテジェリン誘導体及びその用途 (2015)
  • 発明者名: 青木和広、加藤玄樹、大谷啓一
  • 権利者名: 青木和広、加藤玄樹、大谷啓一
  • 産業財産権種類: 特許
  • 産業財産権番号: 2015－48698
  • 出願年月日: 2015-03-11