| 研究課題/領域番号 |
25293380
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| 研究機関 | 福岡歯科大学 |
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研究代表者 |
岡部 幸司 福岡歯科大学, 歯学部, 教授 (80224046)
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| 研究分担者 |
岡本 富士雄 福岡歯科大学, 歯学部, 講師 (60153938)
福島 秀文 福岡歯科大学, 歯学部, 准教授 (70412624)
鍛治屋 浩 福岡歯科大学, 歯学部, 講師 (80177378)
松下 正之 琉球大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (30273965)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | TRPM7 / ミネラル輸送 / 歯牙石灰化 / エナメル芽細胞 / 象牙芽細胞 / コンディショナルKOマウス |
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| 研究実績の概要 |
歯は上皮―間葉系の相互作用により主に象牙芽細胞とエナメル芽細胞から形成されるが、それぞれの石灰化過程を担う分子の同定は不明である。本研究は歯牙形成に関わる新規分子として、我々が生体中でも特に象牙芽細胞やエナメル芽細胞に極めて高発現するTRP分子として発見したキナーゼ活性を有するユニークなCa2+透過型陽イオンチャネルであるTRPM7に注目し、この分子のミネラル輸送機構とこれに続く歯の発生と石灰化調節機構への関与をin vitro実験系とin vivo実験系の双方で解明することにある。
培株化された象牙芽細胞様細胞及びエナメル芽細胞様細胞を用いて、TRPM7-shRNAによる TRPM7ノックダウンを行うと、TRPM7イオン輸送の抑制と共にCa2+沈着物の形成が優位に低下することより、TRPM7は歯牙の石灰化機構に関与するとことが示唆された。また、TRPM7キナーゼ変異マウス（キナーゼ機能欠型）の歯牙硬組織の解析の結果、マイクロCTや電子顕微鏡解析では石灰化度の低下や硬組織の結晶構造の脆弱化が起こっていることが明らかとなった。一方、歯牙形成や石灰化過程におけるTRPM7のイオン輸送自体の役割をin vivo実験系で解明するために、我々が作成したTRPM7-floxマウスの再調整や象牙芽細胞及びエナメル芽細胞に特異的タンパクCreマウスの調整ができた。今後の交配により、象牙芽細胞及びエナメル芽細胞に特異的なTRPM7コンディショナル欠損マウス作製の準備が整った。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
平成26年度は、当初の計画に沿って下記①～③の実験を実施し実績を得た。
① 培株化された象牙芽細胞様細胞及びエナメル芽細胞様細胞には、線維芽細胞に比較するとTRPM7が高発現しており、象牙芽細胞様細胞及びエナメル芽細胞様細胞を用いてTRPM7-shRNAによる TRPM7ノックダウンを行うと、双方の細胞においてTRPM7イオン輸送の抑制と共にCa2+沈着物の形成が優位に低下することより、TRPM7は歯牙の石灰化機構に関与するとことが示唆された。 ② TRPM7キナーゼ変異マウス（キナーゼ機能欠型）では前歯が白色化すると共に、歯牙硬組織の解析の結果、マイクロCTや電子顕微鏡解析では石灰化度の低下や硬組織の結晶構造の脆弱化が起こっていることが明らかとなった。 ③ 歯牙形成や石灰化過程におけるTRPM7のイオン輸送自体の役割をin vivo実験系で解明するために、我々が作成したTRPM7-floxマウスの再調整や象牙芽細胞及びエナメル芽細胞に特異的タンパクCreマウスの調整ができた。今後の交配により、象牙芽細胞及びエナメル芽細胞に特異的なTRPM7コンディショナル欠損マウス作製の準備が整った。
以上の①と②に関しては、研究計画上、充分な研究結果が得られており、③に関してもコンディショナル欠損マウス作製が現在進行形である。従って、平成26年度の研究計画の達成度はおおむね順調に進展していると考えられる。
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| 今後の研究の推進方策 |
平成26年度に得られた結果を基にして、以下の計画を進める。
① 胎生期から歯牙形成期までの歯牙組織におけるTRPM7の発現分布や象牙質やエナメル質における位置的な局在を検討し、組織発生や石灰化機構にどの時期に関与が深いかを検討する。また、歯牙組織から採集した野生型の象牙芽細胞及びエナメル芽細胞や培養細胞や株化細胞より誘導された象牙芽細胞及びエナメル芽細胞を用いて、in vitro実験系でTRPM7分子のCa2+やMg2+輸送機能や石灰化に関わる分子の発現機能との連関を解析する。② TRPM7キナーゼ変異マウスの歯牙硬組織へのin vivo表現型の形態解析や組織解析をさらに詳細に行うことで、TRPM7の歯牙形成や石灰化過程におけるin vivoでの役割を解明する。また、TRPM7キナーゼ変異マウスの歯杯または歯髄細胞等を用いてTRPM7が欠損した象牙芽細胞及びエナメル芽細胞を誘導し、前述①の野生型のTRPM7発現細胞と比較しながらin vitro実験系でTRPM7分子のCa2+やMg2+等のミネラル輸送機構や石灰化物形機能との連関を解析する。③ 平成26年度にTRPM7-floxマウスと象牙芽細胞及びエナメル芽細胞に特異的タンパクCreマウスの準備ができたので、平成27年度はこれらのマウスの交配により、象牙芽細胞及びエナメル芽細胞に特異的なTRPM7コンディショナル欠損マウスを作製し、歯牙硬組織へのin vivo表現型の形態解析や組織解析を行うことで、TRPM7の歯牙形成や石灰化過程におけるin vivoでの役割を解明する。
以上までのin vitro実験系とin vivo実験系の成果をまとめて、複数の学会発表を行うと共に、論文作成準備を行い海外の学術雑誌へ投稿する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
平成26年度に次年度使用額が生じた理由として、当初計画として、TRPM7コンディショナル欠損マウスを作製のために必要な象牙芽細胞及びエナメル芽細胞に特異的タンパクCreマウスを複数種類導入し、購入や導入に関する費用や飼育費等に予算を支出することで進めていたが、実験動物メーカーからの一部の動物導入がずれ込んでいるため、これらに関わる経費が次年度使用額となった。
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| 次年度使用額の使用計画 |
平成27年度は、残りのCreマウス導入や動物飼育経費、及び種々のTRPM7コンストラクトの作製費用等に、次年度使用額と合わせて使用していく予定である。
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