乳歯歯髄由来ヒトiPS細胞からの歯形成細胞への分化誘導制御

2016 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 25293418
• 研究機関: 新潟大学
• 研究代表者: 齊藤 一誠 新潟大学, 医歯学系, 准教授 (90404540)
• 研究分担者: 山崎 要一 鹿児島大学, 歯学部, 教授 (30200645) ; 佐藤 正宏 鹿児島大学, 医療ミニブタ先端医療開発研究センター, 教授 (30287099) ; 齊藤 陽子 新潟大学, 医歯学系, 助教 (30404487) ; 稲田 絵美 鹿児島大学, 医学部・歯学部附属病院, 助教 (30448568) ; 松山 清 久留米工業高等専門学校, 生物応用化学科, 准教授 (40299540) ; 野口 洋文 琉球大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (50378733) ; 大島 勇人 新潟大学, 医歯学系, 教授 (70251824)
• 研究期間 (年度): 2013-04-01 – 2017-03-31
• キーワード: 再生歯学 / 小児歯科学 / iPS細胞 / 歯髄幹細胞 / 乳歯

研究実績の概要

歯科臨床において、上下顎20本ある乳歯は交換に伴い脱落し、子どもの記念に保存する以外はほとんどが廃棄されている。しかし、バイオリサイクルの観点から、乳歯は歯髄幹細胞の有効な細胞供給元として注目されている。
Lymphoid enhancer factor-1(LEF1)は、48-kDの核タンパク質であり、Wnt/β-cateninシグナルにおける転写因子として知られる。また、LEF1は、未分化な胚性幹細胞（ES細胞）における未分化の維持・増殖に関与することが報告されており、本研究では、iPS細胞から遺伝子工学的手法を用いてLEF1陽性細胞を単離することで、幹細胞レベルでの分化誘導制御を目的とした。乳歯歯髄細胞に山中４因子を導入後、乳歯由来iPS細胞を樹立し、以下の結果を得た。１）乳歯歯髄細胞由来iPS細胞を安定的に樹立することが可能となった。２）樹立したiPS細胞への遺伝子導入が可能かどうかの検討を行い、piggyBac transposonシステムの応用により、ゲノムへの挿入による安定発現株の樹立が可能であった。３）ヒトLEF1プロモーターを用いた遺伝子工学的手法により、初代培養細胞からLEF1陽性細胞の単離が可能となった。４）このLEF1陽性細胞について、歯髄幹細胞マーカーであるSTRO-1、CD44およびSSEA-4は免疫染色陽性で、かつ、RT-PCR法にて、いずれの細胞株においてもOCT3/4、SOX2、NANOGおよびREX1が検出され、LEF1陽性細胞が幹細胞特性を有することが明らかとなった。５）乳歯歯髄細胞由来iPS細胞へヒトLEF1プロモーターを配したプラスミドベクターを遺伝子導入後、分化誘導を行ったところ、LEF1陽性の歯髄幹細胞様の細胞を得ることができた。これらの細胞は、乳歯歯髄幹細胞であるSHEDと同様の遺伝子発現を有していた。

現在までの達成度 (段落)

28年度が最終年度であるため、記入しない。

今後の研究の推進方策

28年度が最終年度であるため、記入しない。

次年度使用額が生じた理由

28年度が最終年度であるため、記入しない。

次年度使用額の使用計画

28年度が最終年度であるため、記入しない。

研究成果

• [雑誌論文] Isolation and characterization of lymphoid enhancer factor-1-positive deciduous dental pulp stem-like cells after transfection with a piggyBac vector containing LEF1 promoter-driven selection markers (2017)
  • 著者名/発表者名: Tomoya Murakami, Issei Saitoh, Masahiro Sato, Emi Inada, Miki Soda, Masataka Oda, Hisanori Domone, Yoko Iwase, Tadashi Sawami, Kazunari Matsueda, Yutaka Terao, Hayato Ohshima, Hirofumi Noguchi, Haruaki Hayasaki
  • 雑誌名: Archives of Oral Biology 巻: 印刷中 ページ: -
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Efficient CRISPR/Cas9-based gene correction in induced pluripotent stem cells established from fibroblasts of patients with sickle cell disease (2016)
  • 著者名/発表者名: Masahiro Sato, Issei Saitoh, Emi Inada
  • 雑誌名: Stem Cell Investigation 巻: 3 ページ: 78
  • DOI: doi: 10.21037/sci.2016.11.05
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] The piggyBac-based gene delivery system can confer successful production of cloned porcine blastocysts with multigene constructs (2016)
  • 著者名/発表者名: Masahiro Sato, Kosuke Maeda, Miyu Koriyama, Emi Inada, Issei Saitoh, Masato Ohtsuka, Shingo Nakamura, Takayuki Sakurai, Satoshi Watanabe, Kazuchika Miyoshi
  • 雑誌名: International Journal of Molecular Sciences 巻: 17 ページ: pii: E1424
  • DOI: doi: 10.3390/ijms17091424.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] 遺伝子工学的手法による不死化ヒト乳歯歯髄細胞株の樹立と特性解析 (2017)
  • 著者名/発表者名: 稲田絵美，齊藤一誠，窪田直子，村上智哉，左右田美樹，澤味 規，松枝一成，早崎治明，山崎要一
  • 学会等名: 第55回日本小児歯科学会大会
  • 発表場所: 西日本総合展示場（福岡県北九州市）
  • 年月日: 2017-05-25 – 2017-05-26
• [学会発表] The genetic engineering-based isolation of lymphoid enhancer-binding factor-1 (LEF1) positive stem-like cells from human deciduous tooth cell-derived iPSCs (2016)
  • 著者名/発表者名: Tomoya Murakami, Issei Saitoh, Masahiro Sato, Emi Inada, Miki Soda, Yoko Iwase, Tadashi Sawami, Ayako Suzuki, Hayato Ohshima, Haruaki hayasaki.
  • 学会等名: 10th Biennial Conference of the Pediatric Dentistry Association of Asia in conjunction with 54th Annual Conference of the Japanese Society of Pediatric Dentistry
  • 発表場所: 東京ドームホテル（東京都文京区）
  • 年月日: 2016-05-26 – 2016-05-27
  • 国際学会
• [備考] 新潟大学 医歯学総合研究科 小児歯科学分野
  • URL: http://www.dent.niigata-u.ac.jp/pedo/pedo.html