半導体シーケンサーによる口腔フローラの網羅的解析結果と健康との関連性の解明

2013 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 25293428
• 研究種目: 基盤研究(B)
• 研究機関: 九州大学
• 研究代表者: 山下 喜久 九州大学, 歯学研究科(研究院), 教授 (20192403)
• 研究分担者: 竹下 徹 九州大学, 歯学研究科(研究院), 准教授 (50546471) ; 古田 美智子 九州大学, 歯学研究科(研究院), 助教 (20509591) ; 清原 裕 九州大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (80161602) ; 江島 伸興 大分大学, 医学部, 教授 (20203630)
• 研究期間 (年度): 2013-04-01 – 2017-03-31
• キーワード: 口腔フローラ / 網羅的解析 / 16S rRNA遺伝子 / 次世代シーケンサー / 分子疫学

研究概要

本年度は平成19年に実施した大規模一斉健康診査で得られた唾液サンプルから既に抽出済みの口腔細菌群集DNA を基に各検体の16S rRNA遺伝子のV1-V2領域のPCR法による増幅を行った。細菌共通配列である8F (5’- AGA GTT TGA TYM TGG CTC AG -3’) にシーケンス用のアダプター配列と異なるタグ配列を付与したフォワードプライマー192種とアダプター配列を付与した338R (5’- AGA GTT TGA TYM TGG CTC AG -3’) を作製した。これらを用いて得られた増幅産物192検体を精製した後混合し、半導体シーケンサー Ion PGM (Life Technologies社) を用いてシーケンスを行った。Ion 318 chip (Life Technologies社) を用いることで1検体あたり3000リード以上のリードが得られることを確認した。得られた塩基配列について相当する細菌種の分析を行ったところ唾液検体においてはこれまで報告されてきたとおり、Streptococcus, Actinomyces, Rothia, Granulictella, Prevotella, Veillonella, Neisseria, Haemophilus, Fusobacterium, Gemella, Porphyromonas といった菌属が検出されることを確認した。

現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

Ion PGMを用いた16S rRNA遺伝子塩基配列解析法を確立することができた。一方でシーケンサーの実験条件の最適化には想定していた以上の時間がかかり、また一部検体については再解析が必要となったことから、平成19年採取検体の解析を完了することができなかった。このことから達成度はやや遅れていると判断した。

今後の研究の推進方策

平成24年の健康調査で採取された唾液について、唾液サンプルからビーズ破砕法を用いて細菌DNAを抽出し、これをテンプレートとしてPCRによりアンプリコンを増幅し、平成19年度のサンプルと同様に半導体シーケンサーを用いたシーケンスを行う。得られたシーケンスデータと平成19年の一斉健康診査で得られている下記の口腔および全身の健康状況の健康指標を用いて、平成19年の健康調査時の唾液中細菌構成と各健康指標との関連性の横断的分析を行う。
① 口腔の健康評価：歯周組織の評価は米国国民栄養調査 (NHANES III) と同様の方法で、プロービングデプス、アタッチメントロス、プロービング後の出血、口腔清掃状態等を記録したもの。歯冠部齲蝕については学校歯科保健の診査基準に準じてCとCOを検出したもの、根面齲蝕についてはWHOの基準に準じてCを検出したもの。また、口腔粘膜病変については白板症、扁平苔癬、潰瘍、カンジダ症などの有無とその部位について診査し、WHOの基準に準じて記録したもの。
② 全身の健康：心電図、肥満度（BMIおよび体脂肪率）、ウエストヒップ比、血液生化学検査(HbA1c、AST、ALT、ALP、LAP、LDH、γ-GTP、アミラーゼ、総コレステロール、HDL-コレステロール、LDL-コレステロール、中性脂肪、チモール、クンケル、総ビリルビン、尿素窒素、クレアチン、尿酸、総蛋白、アルブミン、A/G比、白血球数、赤血球数、血小板数、Na、K、Cl、Ca、IP、血清鉄など)、糖負荷試験（空腹時血糖値、2時間値、空腹時インスリン値、2時間値）、血圧、眼底検査、骨密度など。なお、インスリン抵抗性の指標としてはHoma's index（空腹時血糖値 (mg/dl) × 空腹時インスリン(mU/ml)÷405）を用いる。

次年度の研究費の使用計画

一部検体については再解析が必要となり、平成19年採取検体の解析を完了することができなかったことから、次年度使用額が生じた。
次年度はDNA抽出用試薬、PCR用試薬、半導体シーケンサーのチップ及び試薬等の消耗品についての利用を予定している。

研究成果

• [雑誌論文] 口腔マイクロバイオーム解析の歯科医学における臨床的意義 (2014)
  • 著者名/発表者名: 山下喜久,竹下徹
  • 雑誌名: 実験医学 巻: 32 ページ: 733-738
• [雑誌論文] 口腔疾患とマイクロバイオーム (2013)
  • 著者名/発表者名: 山下喜久、竹下徹
  • 雑誌名: 医学のあゆみ 巻: 246 ページ: 1089, 1093
• [雑誌論文] 口腔のマイクロバイオーム (2013)
  • 著者名/発表者名: 竹下徹、山下喜久
  • 雑誌名: 細胞工学 巻: 32 ページ: 1125, 1128
• [学会発表] Comparison of salivary microbiota between Japanese and Koreans
  • 著者名/発表者名: Y. Yamashita, T. Takeshita, K. Matsuo, D-H Han, H-D Kim
  • 学会等名: Cell Symposia Microbiome and Host Health
  • 発表場所: Lisbon, Portugal
• [学会発表] 口腔の健康な成人の口腔常在フローラの構成
  • 著者名/発表者名: 竹下徹、深水薫、嶋崎義浩、古田美智子、柴田幸江、清原裕、山下喜久
  • 学会等名: 第17回腸内細菌学会
  • 発表場所: 東京都港区白金
• [学会発表] 久山町コホート研究における口腔と全身の健康の関連性解明へのアプローチ
  • 著者名/発表者名: 山下喜久
  • 学会等名: 第72回日本公衆衛生学会
  • 発表場所: 三重県津市
  • 招待講演
• [学会発表] 分子疫学的手法を用いた宿主の健康に関わる口腔マイクロバイオームの探索
  • 著者名/発表者名: 竹下徹
  • 学会等名: 第87回日本細菌学会総会
  • 発表場所: 東京江戸川区船堀
• [学会発表] 口腔マイクロバイオーム解析の臨床的意義
  • 著者名/発表者名: 山下喜久
  • 学会等名: Roche Scientific Symposium 2013
  • 発表場所: 東京ステーションカンファレンス
  • 招待講演