| 研究課題/領域番号 |
25305010
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 応募区分 | 海外学術 |
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| 研究機関 | 国立感染症研究所 |
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研究代表者 |
沢辺 京子 国立感染症研究所, 昆虫医科学部, 部長 (10215923)
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| 研究分担者 |
伊澤 晴彦 国立感染症研究所, 昆虫医科学部, 室長 (90370965)
佐々木 年則 国立感染症研究所, 昆虫医科学部, 主任研究官 (10300930)
水谷 哲也 東京農工大学, 農学部, 教授 (70281681)
比嘉 由紀子 長崎大学, 熱帯医学研究所, 助教 (40404561)
山内 健生 兵庫県立大学, 自然・環境科学研究所, 准教授 (00363036)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | 蚊媒介性ウイルス / マダニ媒介性ウイルス / RDV法 / 次世代シークエンス解析 / アルボウイルス分布図 / リスクマップ作製 / 国際情報交換 |
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| 研究概要 |
東南アジアにおける節足動物媒介性ウイルスの自然界での多様性の実態把握を目標とし，フィリピン・ベトナム・韓国から得られる，蚊・ダニ類が保有する未知の病原ウイルスをRDV法および次世代・第三世代シーケンサーを使用して網羅的かつ総合的に探索し，東南アジア地域からの蚊・ダニ媒介性ウイルス感染症の日本への侵入監視，アウトブレークに対応する危機管理体制構築に貢献することを目指した．
2010年フィリピンのルソン島の各地で捕集されたネッタイシマカ，ヒトスジシマカ，クロヤブカ属蚊をウイルス分離に供した．合計44プールの蚊乳剤をC6/36細胞に接種し，続く2回の盲継代を行った結果，クロヤブカ属蚊の5プールにおいて強い細胞変性効果が観察された．既知ウイルス（フラビウイルス，トガウイルス，ブニヤウイルス，レオウイルス）の遺伝子検出を試みたが全て陰性であったが，新規ウイルスの存在が予想されため，引き続きこれらの培養上清から抽出したRNAをもとに，次世代シークエンサーによる解析を行い，ウイルス種の同定を目指している．
一方，国内で捕集されたマダニ類のプール乳剤をBHKあるいはVero細胞に接種し，培養上清よりRNAを抽出した．CPEが観察された1プールに関しては，Nextera XTシステムを用いてアンプリコンを作成し，50サイクル用のreagent kitを用いてMiSeqで2回の解析を行った．1回目は8検体で約1,600万リード，2回目は3検体で約1,600万リードのデータが得られた．PC による解析ではローカルブラストとマッピングを行った．フィリピンでのマダニ調査は，ロスバーニョス市内の植物園・大学構内および郊外の牧場・林道等でフランネル法の指導を行なったが，オウシマダニ幼虫が少数採集されただけであった．今後の調査に関してフィリピン大学マニラ校のBertuso准教授と打ち合わせた．
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
国内外の捕集蚊は，これまでの蓄積が大量にあり，RDV法ならびに次世代・第三世代シークエンス法による解析を順調に進めている．
マダニに関しては，本研究では1年目の取り組みであり，使用する培養細胞の選択を考慮しながらではあるが，積極的にウイルス分離を実施していることもあり，CPEを呈する培養上清がいくつか確認できている．それらは上述したと同様の手順で順次次世代シークエンス法による解析を進めている．
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| 今後の研究の推進方策 |
蚊・マダニのウイルス分離を継続し，分離株においてはさらに詳細なウイルス学的解析を進める．
一方でフィリピンにおけるマダニ調査に関しては，昨年度の調査において，調査地の選択ができなかったことから，今年度改めて調査地に関する打合せを行い，4回の調査を計画している．
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| 次年度の研究費の使用計画 |
フィリピンにおいてマダニ調査地の選定がうまくいかなかったため，予定していた調査が一度しか実施できなかった．次年度に調査地の選定ならびに調査方法の打合せを行う予定である．
１．消耗品費：前年度と同様に計上する．1)ウイルス分離に関わるディスポーザブル器具・ガラスシャーレ、培地等．2)次世代・第三世代シークエンス解析に関わる消耗品
２．海外旅費：フィリピンにおいて，少なくとも4回の調査を計画する．それに伴う渡航費
３．謝金（フィリピンにおける調査協力に対する謝金）およびその他費（試料・試薬類の送付等）
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